【醫學百科●抗原】

楊籍富

【醫學百科●抗原】

 

拼音

 

kàngyuán

 

英文參考

 

antigen抗原（antigen）是一類能刺激機體的免疫系統，使之發生免疫應答，產生抗體與致敏淋巴細胞等，并能與相應抗體或致敏淋巴細胞在體內或體外發生特異性結合反應的物質。

 

因此，抗原必須具有兩種性能：刺激機體產生免疫應答的免疫原性；

 

與相應免疫應答的產物（抗體或致敏淋巴細胞等）發生特異性結合的免疫反應性。

 

構成抗原的條件

 

構成抗原的條件是異物性、特異性及大分子性。

 

異物性是指機體的免疫活性細胞并未接觸過的物質，或化學結構與機體自身成分不同。

 

具備異物性的物質有三種：（1）異種物質，種族關系相距越遠，組織結構間的差異越大，免疫原性越強。

 

如馬血清及各種微生物與人的血緣關系遠，故免疫原性就強；

 

而馬血清對驢來說，血緣關系很近，免疫原性也相對地弱。

 

（2）同種異體物質，即同種但不同個體間的物質。

 

如人的紅細胞抗原（如ABO血型抗原）和人白細胞抗原等。

 

（3）自身物質，自身物質一般不具免疫原性。

 

但有些物質如自身隱蔽成分（晶體蛋白、精子等），在正常情況下借助屏障與免疫系統隔絕，一旦屏障破壞，則會漏入血流與免疫活性細胞接觸，成為自身抗原。

 

因此，自身物質經外傷、感染、藥物及射線的影響，理化性質發生改變時，也可成為具有免疫原性的抗原物質。

 

特異性即專一性。

 

抗原的特異性表現在兩方面：一是刺激機體產生高針對性的免疫應答；

 

二是只能與其對應的抗體或致敏淋巴細胞結合而出現反應。

 

如傷寒桿菌抗體只對傷寒桿菌起作用，對痢疾桿菌無作用，反之亦然。

 

抗原的特異性是由抗原分子表面的特殊的化學集團的性質所決定的。

 

這種決定和控制抗原特異性的特殊化學集團，稱為抗原決定簇。

 

大分子性即抗原物質的分子量都比較大，通常在1萬以上。

 

分子量越大，抗原性越強。

 

除此以外，作為抗原的大分子必需具有苯環氨基酸，而且這些苯環氨基酸必須暴露在該復合物分子的表面。

 

抗原的種類

 

抗原的種類很多，可分為以下幾大類：根據抗原物質所起的作用，分為完全抗原和半抗原。

 

完全抗原（completeantigen）簡稱抗原。

 

是一類既有免疫原性，又有免疫反應性的物質。

 

如大多數蛋白質、細菌、病毒、細菌外毒素等都是完全抗原。

 

半抗原（hapten）是只具有免疫反應性，而無免疫原性的物質，故又稱不完全抗原。

 

半抗原與蛋白質載體結合后，就獲得了免疫原性。

 

又可分為復合半抗原和簡單半抗原。

 

復合半抗原不具有免疫原性，只具免疫反應性，如絕大多數多糖（如肺炎球菌的莢膜多糖）和所有的類脂等；

 

簡單半抗原既不具免疫原性，又不具免疫反應性，但能阻止抗體與相應抗原或復合半抗原結合。

 

如肺炎球菌莢膜多糖的水解產物等。

 

根據產生抗體時是否需要T細胞輔助，可分為胸腺依賴性抗原和非胸腺依賴性抗原。

 

胸腺依賴性抗原（thymusdependentantigen，TD-Ag）需要巨噬細胞、胸腺依賴性淋巴細胞（T細胞）和B細胞相互協助，才能刺激機體產生抗體的抗原。

 

自然界中多數抗原屬于此類。

 

如人血清球蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、白喉類毒素、羊紅細胞、大腸桿菌噬菌體和傷寒桿菌鞭毛抗原等。

 

此類抗原刺激機體產生的抗體多為IgG（免疫球蛋白G）。

 

非胸腺依賴性抗原（thymusindependentantigen，TI-Ag）能在無胸腺或無胸腺依賴性淋巴細胞（T細胞）的機體內引起抗體產生的抗原。

 

如細菌的脂多糖、肺炎雙球菌莢膜多糖和聚合鞭毛等。

 

所產生的抗體僅有IgM（免疫球蛋白M），而且多不引起免疫記憶。

 

根據與機體的親緣關系，分為同種異體抗原、自身抗原等。

 

同種異體抗原（alloantigen）存在于人和同種動物的不同個體（同卵孿生者除外）的抗原物質。

 

當一個個體的細胞或組織進入另一機體時，可引起免疫應答。

 

人類血液中的紅細胞血型抗原和白細胞抗原均屬此類。

 

例如A型紅細胞輸入B型機體，B型機體內的抗A抗體能凝集A型紅細胞，在補體參與下，導致A型紅細胞溶解，發生輸血反應。

 

在人類白細胞和其他組織細胞的細胞膜上所具有的人類白細胞抗原，又稱組織相容性抗原，除同卵孿生者外，皆不相同。

 

因此在同種異體間進行皮膚及器官移植時，可引起移植排斥反應。

 

自身抗原（autoantigen）是能引起自身免疫應答的自身組織成分。

 

一般自身組織對機體沒有抗原性，但在外傷、感染、電離輻射、藥物等影響下，可以發生變性成為自身抗原，刺激機體產生免疫反應。

 

又可分為隱蔽的自身抗原和修飾的自身抗原兩類。

 

隱蔽的自身抗原在正常情況下與血流和免疫系統相對隔絕，或釋放的抗原量很少，當外傷、感染或手術不慎等原因，使這些物質進入血流時，則可引起自身免疫應答。

 

如甲狀腺球蛋白抗原的釋放引起變態反應性甲狀腺炎；

 

眼葡萄膜色素抗原釋放引起交感性眼炎；

 

精子抗原釋放引起男性不育；

 

腦脊髓和神經抗原釋放引起脫髓鞘腦脊髓炎和外周神經炎等。

 

修飾的自身抗原是機體自身組織在病原微生物感染、電離輻射、藥物等影響下，分子結構發生改變后形成的，可以刺激自身機體產生免疫應答，引起自身免疫病。

 

如有的患者服用安替匹林或匹拉米洞等藥物，可改變白細胞的某些表面化學結構，形成新的抗原決定簇，成為自身抗原。

 

抗原的制備

 

免疫原（抗原）是誘導機體產生抗體、并能與抗體發生反應的物質。

 

能否制得合格的抗體由許多因素決定，而能否制備合格的免疫原則是其前提條件。

 

而且作為診斷試劑的抗原也必須是單一特異性的，即純化的抗原。

 

自然眾多的物質皆可成為免疫原，但絕少是單一成分（除非是合成的基因工程制備的），所以必須將某個抗原從復雜的組分中提取出單一的成分。

 

下面介紹有代表性的免疫原制備方法。

 

顆粒性抗原的制備顆粒性抗原主要是指細胞抗原或細菌抗原。

 

最常用的細胞抗原為制備溶血素用的綿羊紅細胞。

 

這種抗原制備比較簡單，采集新鮮綿羊紅細胞，以無菌鹽水洗滌3次（每次離心2000r/min10min），最后配成106/ml濃度的細胞懸液，即可應用。

 

細菌抗原多用液體或固體培養物經集菌后處理。

 

H抗原用有動力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理，而O抗原則需要100℃加溫2～2.5h后應用。

 

Vi抗原則應在殺菌后再加0.5％～1％氯化鈣溶液。

 

有時蟲卵也可做成抗原，如日本血吸蟲卵抗原可制成懸液供免疫用。

 

有些細胞膜成分，如組織細胞膜、血細胞膜經打碎后亦可制成顆粒抗原。

 

顆粒抗原懸液呈乳濁狀，多采用靜脈內免疫法，較少使用佐劑作皮內注射。

 

可溶性抗原的制備和純化蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、細菌毒素、酶、補體等皆為良好的可溶抗原。

 

但因這些蛋白質多為復雜的蛋白組分，免疫前需進行純化。

 

蛋白質純化方法在生物化學技術中已有詳述，本章主要介紹免疫化學純化方法。

 

組織和細胞粗抗原的制備免疫原多來源于只類及動物的組織或細胞，這些材料在取得可溶性蛋白質之前，必須先進行處理，以適合于進一步純化。

 

1．組織細胞抗原的制備所用組織必須是新鮮的或低溫（＜－40℃）保存的。

 

器官或組織得到后立即去除表面的包膜或結締組織以及一些大血管。

 

如有條件，臟器應進行灌注，除去血管內殘留的血液。

 

處理好的組織用0.05/NaN3生理鹽水洗去血跡及污染物。

 

將洗凈的組織剪成小塊，進行粉碎。

 

粉碎的方法有兩類：①高速組搗碎機法。

 

操作時，將組織加鹽水（約1/2）裝入搗碎機筒內，用高速（約1000r/min）間斷進行，每次30～60s，時間過長會產熱。

 

②研磨法。

 

可用玻璃勻漿器或乳缽研磨。

 

玻璃勻漿器是由一內壁經過磨砂的玻璃管和一根一端為圓柱狀（表面亦經磨砂）的磨桿組成，主要經過旋轉、壓擠將組織粉粹。

 

研磨法可用于韌性較大聽組織，如皮膚、空腔器官等。

 

為了更有效地磨碎組織，有時在研磨時加入淘洗過的海砂。

 

組織勻漿通過2000～3000r/min離心10min后分成兩個部分：沉淀物含有大量的組織細胞和碎片；

 

上清液作為提取可溶性抗原的材料，提取前還要通過1000～2000r/min20～30min的高速離心，以除去微小的細胞碎片，此時上清液應澄清。

 

2．組織細胞或培養細胞可溶性抗原的制備制備抗原用的細胞包括正常細胞、病理細胞（如腫瘤細胞）或傳代細胞。

 

組織細胞的制備一般通過上述機械破碎后取得。

 

或通過酶消化，所用的酶大多為胃蛋白酶或胰酶。

 

通過酶解將細胞間質蛋白消化，獲得游離的單個細胞。

 

細胞抗原一般分為三個組分：膜蛋白抗原、細胞漿抗原（主要為細胞器）和細胞核及核膜抗原。

 

三種抗原的制備皆需將細胞破碎，方法有如下幾種。

 

（1）反復凍融法：將待破碎的細胞（有時為整塊組織）置－20冰箱內凍結，然后緩慢地融化。

 

如此反復2次，大部分組織細胞及細胞內的顆粒可被融破。

 

（2）冷熱交替法：在細菌或病毒中提取蛋白質及核酸時可用此法。

 

操作時，將材料投入沸水浴中，90℃左右維持數分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。

 

（3）超聲破碎法：對微生物和組織細胞多用此法。

 

處理效果與樣品濃度和使用頻率有關。

 

一般組織細胞皆易破碎，而細菌，尤其是真菌的厚膜孢子則較難打破。

 

超聲波所使用的頻率從1～20kHz不等。

 

同樣要間歇進行，因長時間超聲也會產熱，易導致抗原破壞。

 

一次超聲1～2min，總時間為10～15min。

 

（4）自溶法：利用組織和微生物的自身酶系，在一定的pH和溫度下，使其細胞裂解。

 

自溶的溫度，對動物組織細胞常選0～4℃，而對微生物常選室溫。

 

自溶時常需加入少量防腐劑，如甲苯或氯仿等，NaN3不宜使用，因其能抑制酶的活力。

 

（5）溶菌酶處理法：在堿性條件下（pH8.0），溶菌酶可專一破壞細菌細胞壁，適用于多種微生物。

 

除溶菌酶外，蝸牛酶、纖維素酶等也可用于消化細菌和組織細胞。

 

（6）表面活性劑處理法：常用的有十二烷基吡啶、支氧膽酸鈉等。

 

因效果較差，已少應用。

 

超速離心和梯度密度離心法超速離心是分離亞細胞及蛋白質大分子的有效手段，往往是進一步純化的第一次過篩。

 

超速離心又分差速離心和梯度離心。

 

差速離心系指低速與高速離心交替進行，用于分離大小差別較大的顆粒。

 

梯度密度離心是一種區帶分離法，通過梯度密度來維持重力的穩定性。

 

通過離心，沉淀的顆粒比液體的比重大，漂浮的顆粒比液體的比重小。

 

通常待分離的懸液中的顆粒比液體重，假如要使之上浮，必須加入第三種成分，使其密度連續或不連續地升高，形成所謂梯度。

 

第三種成分多用甘油、蔗糖、氯化銫或氯化銣等。

 

假如梯度柱的范圍所表現的密度同待分離顆粒的密度大致相等時，則經過較長時間離心可得到分離。

 

這種方法稱為密度離心或梯度離心。

 

用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據抗原的比重特點分離的方法，除個別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。

 

目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質如載脂蛋白A、B等。

 

對于大量的中、小分子量蛋白質，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。

 

選擇性沉淀法選擇性沉淀是采用各種沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。

 

1．核酸去除法從微生物或細胞提取蛋白質抗原時，其中常含有大量核酸成分。

 

除去核酸可用提取沉淀劑，如氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。

 

核糖核酸降解法較為簡便，用DNA或RNA酶與提取液共同作用30～60min（4℃），即可有效地除去核酸成分。

 

2．鹽析沉淀法這是最古老而又經典的蛋白質純化分離動技術。

 

由于方法簡便、有效、不損害抗原活性等優點，至今仍被廣泛應用。

 

（1）抗原的粗篩：用不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉可將一個復雜的組織液吩成若干組分，也可收集某一飽和度的鹽析沉淀物作為進一步純化的粗篩物。

 

最常用的鹽析劑是33％～50％飽和度的硫酸銨。

 

（2）提取丙種球蛋白：丙種球蛋白主要為IgG（95％以上）。

 

將35％～40％飽和度的硫酸銨沉淀物經去鹽后可直接用于某些試驗作為抗體試劑。

 

此法簡單、穩定、固收率高，已成為免疫化學試驗的常規方法。

 

（3）抗原的濃縮：在液體中含量較少的抗原，如尿中的游離輕鏈及離子交換層析洗脫液中的抗原，可通過加入硫酸銨，將其沉淀下來，以利進一步純化。

 

3．有機溶劑沉淀法有機溶劑以降低溶液的介電常數，從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力，導致溶解度降低。

 

另外，有機溶劑與水作用，能破壞蛋白質的水化膜，故蛋白質在一定濃度的有機溶劑中被沉淀析出。

 

使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。

 

高濃度的有機溶劑易引起蛋白質變性、失活、操作必須在低溫下進行。

 

Cohn（1942）低溫酒精沉淀法可將血漿蛋白分為5個組分，IgG屬于Cohn-3組分。

 

4．水溶性非離子型聚合物沉淀法常用的聚合物為聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。

 

水溶性聚合物沉淀蛋白質的機制尚不清楚，大致有如下解釋：①聚合物與蛋白質形成共沉物；

 

①聚合物與蛋白質之間發生水的重分配；

 

①聚合物與蛋白質形成復合物。

 

此法受許多因素影響，主要是pH、離子強度、蛋白質濃度和PEG的分子量等。

 

分子量為2000～6000的PEG皆適宜于做蛋白沉淀用。

 

如若使用得當，效果甚為滿意。

 

一般認為，PEG濃度在3％～4％時沉淀免疫復合物，6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。

 

最突出的應用是用3％～4％的PEG沉淀免疫復合物，未結合的抗原和抗體留在溶液中。

 

按此原理設計了快速測定法和循環免疫復合物測定法。

 

凝膠過濾和離子交換層析凝膠過濾又名分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。

 

離子交換層析是利用一些帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原，將蛋白質抗原按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。

 

這兩種層析如能共同應用或者反復應用其中的一種，皆可將某一蛋白質從一復雜的組分中純化出來。

 

親和層析上面介紹的各種純方法主要是依賴抗原的物理和化學特性，如分子量、攜帶電荷等，經過純化后只能取得相同性質的物質，在免疫特性上是否為同種物質還不能肯定。

 

親和層析是利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設計的層析技術。

 

例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結合成復合物。

 

如果將復合物的一方固定在不溶性載體上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。

 

與上述其他純化方法相比，親和層析能產生相當高的純化作用。

 

另外，此法的優點是迅速，有時僅一步即可達到純化的目的。

 

1．親和層析支持物的選擇作為親和層析支持物須符合以下要求：①非特異性吸附低；

 

②液體通過時流速要快；

 

③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩定；

 

④必須有合適的、豐富的化學基團，能有效地與蛋白質或其它化合物結合；

 

⑤必須帶有豐富的微孔，以增加結合容量。

 

符合以上5個條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。

 

2．配體的選擇所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。

 

良好的配體必須具備以下3個條件。

 

（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。

 

（2）抗原與抗體之間必須有強的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質和數量。

 

對抗體來說還決定于抗體來源動物的種類和免疫時間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；

 

免疫時間短的親和力低。

 

但是，親和力太強也不利，因為解離抗原抗體復合物所需要的條件就要強烈，從而可造成蛋白質的變性。

 

例如用低pH（1.5～2.5）或高鹽（如6mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。

 

（3）配體必須有一個適當的化學基團，這個基團不參與配體和大分子的特異結合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應當影響配體與大分子結合的親和性。

 

3．抗原或抗體與支持物的結合將抗原或抗體結合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結為載體結合法、物理吸附法、交聯法和網絡法4類。

 

結合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團上。

 

用來發生交聯的化學反應必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。

 

交聯后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯的物質。

 

最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時進行處理，則能使支持物活化。

 

此時溴化氰與支持物上的羥式反應形成氨基甲酸酯基團。

 

加入溴化氰的量取決于支持物的量。

 

如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。

 

交聯時首先要注意加入抗原或抗體的濃度。

 

通常在交聯反應混合物中的交聯蛋白質濃度應是親和分離濃度的20～30倍。

 

這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。

 

若希望最終產物含量較少，所加入的溴化氰也應減少。

 

交聯時的pH也應注意，pH9.5～10時，活化的瓊脂糖珠很不穩定。

 

降低pH，也就減少了能反應的配體濃度，交聯量就會減少。

 

親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結合，產生了所謂的無效吸附。

 

另外，Sepharose4B交聯時要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯。

 

基于這兩個原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長度的“手臂”。

 

必要時這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯。

 

常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。

 

這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應，使用極為方便。

 

4．親和層析條件的選擇（1）支持物與抗原或抗體結合后，還可能有多余的活性基團，為了封閉這些殘基團，必須用無關蛋白質或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團。

 

（2）去掉未結合及結合不牢固的蛋白質。

 

先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脫2～3個柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。

 

（3）解脫劑有多種。

 

常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。

 

作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液。

 

免疫球蛋白片段的制備免疫球蛋白具有抗原性，可用以免疫動物制備相應的抗體，而這種抗體常用于免疫球蛋白的檢測。

 

五類免疫球蛋白皆可用前面介紹的純化方法提取出來。

 

如將這些免疫球蛋白分解成片段，如Fc段、Fab段、輕鏈等作為免疫原制備抗血清，則可制得分辨能力更高的特異性抗體。

 

制備方法如下：1．溫和條件析離亞單位亞單位之間以非共價鍵、如氫鍵、靜電引力等連接起來，這些鍵結合力較弱，可經2種方法將其斷開制備片段。

 

第一種方法是改變pH，一般將pH調至3～4（羧基滴定范圍）和9～10（賴氨酸－酪氨酸滴定范圍），當低于3或高于10時，亞單位會離解。

 

這個方法是利用強變性劑，如8mol/L鹽酸胍等。

 

用此可以將亞單位分開。

 

這個方法也用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取。

 

2．二硫鍵的解離二硫鍵是連接Ig肽鏈的共價鍵，解離二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。

 

解離的方法多采用氧化法和還原法。

 

氧化法的優點是切開后，肽鏈不能重新形成二硫鍵，便于肽鏈純化；

 

缺點是甲硫氨酸被氧化成亞砜，色氨酸側鏈被破壞。

 

還原法是將二硫鍵還原成巰基。

 

但這個疏基極不穩定，易再重新結合成二硫鍵，必須及時用碘乙酸或碘代乙酰胺進行羧甲基化。

 

3．溴化氰裂解法溴化氰與蛋白質中的甲硫氨酸側鏈的硫醚基起反應，生成溴化亞氨內酯。

 

此產物與水反應，將肽鏈斷裂。

 

4．酶裂解法因為酶解有極好的專一性，不同的片段可用不同的酶裂解。

 

如木瓜酶可將IgG裂解成Fc和Fab（×2）3個片段，胃蛋白酶可將IgG解成F（ab＇）2和幾個小肽段，胰蛋白酶則將其切成不規則的肽鏈。

 

作為抗原制備常用木瓜酶切斷，取得Fc段，以制備抗鏈血清。

 

作為抗體試劑應用，常用胃蛋白酶切斷取得F（ab＇）2。

 

純化抗原的鑒定純化抗原的鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、結晶法、免疫電泳法、免疫雙擴散法等。

 

事實上，僅用一種方法還無法作純度鑒定，只有幾種方法聯合應用才較可靠。

 

結晶法不是純度的標準，因結晶中往往含有其它成分。

 

電泳譜中呈現單一區帶也不能排除在這條帶中含有其他成分。

 

有時雖出現幾條帶，也可能是同一物質的聚合體或降解物。

 

蛋白抗原的定量可用生化分析中的常用方法。

 

根據測試抗原量的多少可用雙縮脲法或酚試劑法。

 

如果抗原極為寶貴，可用紫外光吸收法。

 

半抗原免疫原的制備多肽、甾族激素、藥物、脂肪胺、核苷等小分子物質僅能與相應的抗體發生特異性結合反應，而它們自己并不是免疫原，不能誘導抗體產生。

 

只有將這種半抗原與蛋白質或其他高聚物結合后才能刺激機體產生抗體。

 

結合的方法有物理法和化學法。

 

物理吸附的載體有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫酸葡聚糖、羧甲基纖維素等，是通過電荷和微孔吸附半抗原。

 

化學法是利用功能團把半抗原以載體上。

 

載體選擇1．蛋白質類蛋白質是結構復雜的大分子膠體物質，是一種良好的載體。

 

常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和血藍蛋白等。

 

其中以牛血清蛋白最為常用，因其溶解度大，免疫活性強，又容易獲得。

 

蛋白質和半抗原結合是通過游離氧基、游離羧基、酚基、巰基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基團的縮合。

 

2．多肽類聚合物是人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚賴氨酸（polylysine）。

 

這種多聚合物與半抗原結合后，可誘發動物產生高滴度、高親和力的抗體。

 

多聚賴氨酸的分子量可達十幾萬到幾十萬，是良好的載體。

 

3．大分子聚合物和某些顆粒PVP、羧甲基纖維素和活性碳等皆可與半抗原結合，加入福氏完全佐劑可誘發產生良好的抗體。

 

因半抗原種類、動物類別、載體種類及結合方法的不同，制得的免疫原對動物免疫所產生的效果也不同。

 

實際應用時，應多采用幾種載體或方法。

 

連接方法半抗原與載體連接要掌握3個基本條件：帶游離氨基或游離羧基以及二種基團皆有的半抗原，如多肽激素類（腦啡肽、胃泌素、ACTH、前列腺素等），它們有游離的氨基或羧基。

 

羧基可用混合酸酐法和碳化二亞胺法與載體氨基形成穩定的肽鍵。

 

同樣，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。

 

亦可用雙功能試劑如戊二醛、甲苯2，4-二異酸鹽與載體氨基連接。

 

脂肪胺可用碳化二亞胺縮合劑或對硝基苯酰氯反應，把脂肪胺變為對硝基苯酰胺，通過加氫還原為氨基苯酰衍生物，再用重氮化反應。

 

②帶有羥基、酮基、醛基的半抗原，如醇、酚、糖、多糖、核苷以及甾族激素等，它們都不能直接與載體連接，需要用化學方法在半抗原上引起羧基后才能與載體連接。

 

③芳香族半抗原由于環上帶有羧基，它鄰位上的氫很活潑，極易取代。

 

半抗原和載體連接的方法在一般實驗室皆可完成，但反應條件應嚴格要求，以防半抗原失活或載體嚴重變性（一般變性并不妨礙）。

 

1．碳化二亞胺法碳化二亞胺是一種化學性質非常活潑的雙功能試劑，常用的水溶性碳化二亞胺化學名為1-乙基-3-（3-二甲氨基）-碳化二亞胺鹽酸鹽。

 

它可與半抗原的羧基、也可與其氨基結合，反應如下： 此連接方法十分簡便，只需將載體蛋白質和抗原按一定比例混合在適當的溶液中，然后加入水溶性碳化二亞胺，攪拌1～2h，置室溫24h，再經透析即可。

 

2．戊二醛法戊二醛也是常用的雙功能交聯劑，它借兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價鍵連接，其反應如下：蛋白質-NH2 半抗原-NH2 COH-（CH2）3-COH→蛋白質-N=CH-（CH2）3-CH=N-半抗原3．氯甲酸異丁酯法該法又稱為混合酸酐法，是利用半抗原上的羧基和載體蛋白上的氨基以肽鏈相連接，方法簡便，多用于類固醇抗原的制備，其反應如下：無羧基和氨基半抗原衍生物的制備某些類固醇和藥物，需加以適當的改造，使其轉變為帶有羧基或氨基的衍生物。

 

依據半抗原的性質有如下4種方法。

 

1．琥珀酸酐法琥珀酸酐是琥珀酸的脫水產物，遇水又可恢復。

 

如果將帶有羥基的半抗原化合物和琥珀酸酐在無水的吡淀中反應，就可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。

 

再經碳化二亞胺可氯甲酸異丁酯法，制備載體半抗原。

 

制備衍生物的反應如下：2．O-（羧甲基）羧胺法帶有酮基的半抗原與O-（羧甲基）羥反應，轉變為帶有羧基的半抗原衍生物。

 

反應式如下：半抗原-C=O H2N-O-CH2COOH→半抗原-C=N=O=CH2-COOH3．一氯醋鈉法帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。

 

其反應式如下：4．重氮的對氨基苯甲酸法先將對氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應，反應產生再作用于帶有酚基的半抗原，獲得帶有羧基的半抗原衍生物。

 

反應式如下：佐劑為了促進抗體產生，可在注射抗原的同時，加入一種輔助劑，這種輔助劑稱為佐劑。

 

佐劑本身可以有免疫原性，也可不具備免疫原性。

 

常用的有免疫原性的佐劑有百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌的內毒素和抗酸桿菌（包括結核分枝桿菌和枯草分枝桿菌）等；

 

非抗原性的佐劑有鋁乳、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、表面活性劑、藻酸鈣、聚核苷酸、胞壁肽等。

 

應用最多的是福氏（Freund）佐劑，是用石蠟油、羊毛脂和卡介苗混合而成。

 

佐劑的作用機制極為復雜。

 

在佐劑－抗原的注射部位，可見到細胞浸潤，幾天后，局部形成肉芽腫（細胞免疫反應）。

 

起初，反應部位以肉芽組織為主，以后則見多量巨噬細胞、漿細胞、巨細胞、類上皮細胞。

 

局部淋巴結和脾中也可見大量漿細胞，提示佐劑可以直接刺激參與免疫反應的細胞并使之增生。

 

有許多佐劑如內毒素、分枝桿菌、小棒狀桿菌、聚核苷酸、皂素等對細胞膜有活化作用，它們可增加巨噬細胞和淋巴細胞的細胞通透性，促進了對抗原的有效處理。

 

佐劑一般是乳劑或懸液，當與水溶液抗原混合后形成一種油包水或水包油的乳狀顆粒，這種顆粒延緩了抗原的吸引，增加了局部刺激作用。

 

另有報告，佐劑和抗原混在一起注射可以改變抗原的分布。

 

應用核素標記的合成多肽或沙門氏菌鞭毛抗原與福氏佐劑混合注入大鼠或豚鼠后肢足掌，測定局部引流淋巴結、脾和血清中的抗原含量，發現它可明顯地延長抗原從局部吸收的時間。

 

對于低分子量的多肽，這一作用較為短暫，而對于鞭毛抗原，這一作用十分明顯。

 

雖然吸收被延緩，但在淋巴結和脾中，抗原的含量都明顯高于不用佐劑的動物。

 

這提示，抗原與佐劑同時應用，可促進抗原在淋巴組織中存留。

 

福氏佐劑分為不完全佐劑（石蠟油＋羊毛脂）和完全佐劑（石蠟油＋羊毛脂＋卡介苗）。

 

佐劑和抗原的比例為1:1。

 

由于佐劑是油劑，加入抗原后要充分混合成乳劑。

 

混合的方法有2種，一為研磨法，二為攪拌混合法。

 

研磨法用一乳缽（玻璃或瑪瑙），先將佐劑加熱傾入，待冷卻后加入卡介苗（2～20mg/ml），再逐滴加入抗原，邊滴邊加速研磨，直至完全變為乳劑為止。

 

另一種方法是用兩個5ml注射器，在接針頭處用一尼龍管連通，一個注射器內是佐劑，另一注射器內為抗原。

 

裝好后來回推注，經多次混合逐漸變為乳劑。

 

本法優點是無菌操作，節省抗原或估劑，用此注射器可直接注射；

 

缺點是不易乳化完全。

 

乳化完全與否的鑒定方法是將一滴乳劑滴入水中，如立即散開，則未乳化好，如不散開漂在水面則為乳化完全。

 

為了防止感染，有時在佐劑中加入抗生素。

 

但抗生素有免疫抑制作用，如能注意無菌操作，就不必加入。

 

引用：http://big5.wiki8.com/kangyuan_103669/