【醫學百科●PCR】

楊籍富

【醫學百科●PCR】

 

拼音

 

PCR

 

英文參考

 

abbr.聚合酶鏈反應(=polymerasechainreaction)

 

英文翻譯

 

PolymeraseChainReaction,PCR

 

聚合酶鏈反應的歷史回顧核酸體外擴增最早的設想由Khorana及其同事于1971年提出：“經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重視該過程便可克隆tRNA基因”。

 

但由于當時很難進行測序和合成寡核苷酸引物，且當時（1970年）Smith等發現了DNA限制性內切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設想被人們遺忘。

 

聚合酶鏈反應的發明直到1985年，美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室Mullis等人才發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction,PCR）,使人們夢寐以求的體外無限擴增核酸片段的愿望成為現實。

 

其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。

 

開始是使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段來擴增人基因組中的特異片段。

 

由于該酶不耐熱，因此，每次加熱變性DNA后都要重新補加Klenow酶。

 

在操作多份標本時，這一過程耗時，費力，且易出錯。

 

耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR反應更易于自動化，繼而PE-Cetus公司推出了第一臺PCR熱循環儀，使該技術的自動化成為現實。

 

Mullis等因此項技術于1993年獲得諾貝爾獎金。

 

聚合酶鏈反應相關技術的發展

 

PCR及其相關技術的發展速度是驚人的。

 

國際上分別于1988年和1990年在美國和英國召開了第一屆和第二屆PCR技術專題研討會。

 

第一屆會議主要討論了PCR的應用與技術本身的優化問題；

 

第二屆會議的主要議題是人類基因組計劃與PCR的最新進展。

 

這充分體現了生物學家對PCR的重視。

 

（表）聚合酶鏈反應的相關技術名稱主要用途簡并引物擴增法擴增未知基因片段巢居PCR提高PCR敏感性、特異性，分析突變復合PCR同時檢測多個突變或病原反向PCR擴增已知序列兩側的未知序列，致產物突變單一特異引物PCR擴增未知基因組DNA單側引物PCR通過已知序列擴增未知cDNA錨定PCR分析具備不同末端的序列增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著PCR有利于產物的分離膜結合PCR去除污染的雜質或PCR產物殘留表達盒PCR產生合成或突變蛋白質的DNA片段連接介導PCRDNA甲基化分析、突變和克隆等RACE-PCR擴增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色體基因原位PCR研究表達基因的細胞比例等臆斷PCR鑒定細菌或遺傳作用通用引物PCR擴增相關基因或檢測相關病原信使擴增表型分型（mapping）同時分析少量細胞的mRNA

 

其它擴增技術

 

與PCR及其相關技術發展的同時，新的擴增技術也不斷誕生。

 

這些技術各有利弊，與PCR互為補充，有的可結合應用，共同構成了核酸體外擴增技術的大家族。

 

我們相信，隨著分子生物學技術的發展，這一家族一定會再涌現出新成員。

 

其它體外核酸擴增技術（表）技術應用轉錄依賴的擴增系統（TAS）檢測HIV連接酶鏈反應（LCR）檢測點突變自主序列復制（3SR）系統研究RNA，臨床應用、法醫學等鏈替代擴增（SDA）檢測、鑒定基因Qβ復制酶系統增加探針檢測敏感性循環探針反應增加探針檢測敏感性連接酶鏈反應（A）連接酶鏈反應（Ligasechainreaction，LCR）,是一種新的DNA體外擴增和檢測技術,主要用于點突變的研究及靶基因的擴增。

 

是Backman1997年為檢出靶基因序列中的點突變而設計發明，并申報了專利。

 

LCR的基本原理為利用DNA連接酶。

 

特異地將雙鏈DNA片段連接,經變性-退火-連接三步驟反復循環,從而使靶基因序列大量擴增。

 

LCR的擴增效率與PCR相當，用耐熱連接酶做LCR只用兩個溫度循環，94℃min變性和65℃復性并連接，循環30次左右。

 

其產物的檢測也較方便靈敏。

 

目前該方法主要用點突變的研究與檢測、微生物病原體的檢測及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態性及單堿基遺傳病的產物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等。

 

依賴核酸序列的擴增（A）依賴核酸序列的擴增（Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA），又稱自主序列復制系統（self-sustainedsequencereplication，3SR）或再生長序列復制技術。

 

1990年Guatelli等首先報道了這一技術。

 

NASBA主要用于RNA的擴增、檢測及測序。

 

其基本方法為：將引物,標本加入擴增反應液，65℃1min使RNA分子二級結構打開,降溫至37℃加入逆轉錄酶,T7RNA聚合酶和RNaseH,并在37℃反應1～1.5小時,其產物經瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶。

 

NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。

 

整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。

 

轉錄依賴的擴增系統（A）轉錄依賴的擴增系統（Transcript-basedamplificationsytem，TAS），是Kwen等人于1989年研究報道的，主要用于擴增RNA。

 

TAS的主要特點是擴增效率高，因為其RNA拷貝數呈10的指數方式增加，只需6個循環靶序列的拷貝數就能達到2×106。

 

它的另一個特點是特異性高，由于TAS只能進行6次溫度循環，錯摻率低，加之用葡聚糖珠夾心雜交，因而特異性也高。

 

雖然本法有較高的特異性和敏感性，但其循環過程復雜，需重復加入逆轉錄酶和T7RNA多聚酶，有待進一步研究。

 

Qβ復制酶反應（A）Kacian等于1972年首次報報Qβ復制酶（Q-betareplicase）催化RNA模板的自我復制功能，它能在常溫30min，將其天然模板MDV-1RNA擴增至109。

 

1986年Chu等報道用生物標記的靶序列特異性探針，可與親和素聯接的MDV-1RNA雜交，經洗脫未被結合的MDV-1后，再加入Qβ復制酶，擴增復制MDV-1拷貝，然后用溴乙錠染色檢測或用同源性的第二探針雜交。

 

Qβ復制酶是一種RNA指導的RNA聚合酶，它有3個特點：①不需寡核苷酸引物的引導就可啟動RNA的合成。

 

②能特異地識別RNA基因中由于分子內堿基配對而形成的特有的RNA折疊結構。

 

③在Qβ復制酶的天然模板MDV-1RNA的非折疊結構區插入一短的核酸序列不影響該酶的復制。

 

因而，如在此區插入核酸探針，則其序列照樣可能被Qβ復制酶擴增。

 

1988年Lizardi等，將靶基因序列插進MDV-1質粒里，用T7RNA聚合酶催化轉錄出MDV-1RNA探針，這種RNA探針可與靶序列雜交，然后洗去非雜交的探針,加入Qβ復制酶來擴增探針，被擴增的探針又可作為模板進行擴增，并呈指數遞增。

 

其產物按上述兩種方法進行檢測。

 

現在該技術又發展了夾心雜交法，分子開關和靶依賴的復制等技術。

 

PCR技術的應用舉例：

 

研究：基因克隆；

 

DNA測序；

 

分析突變；

 

基因重組與融合；

 

鑒定與調控蛋白質結合DNA序列；

 

轉座子插入位點的繪圖；

 

檢測基因的修飾；

 

合成基因的構建；

 

構建克隆或表達載體；

 

檢測某基因的內切酶多態性診斷：細菌（螺旋體、支原體、衣原體、分支桿菌、立克次氏體、白喉桿菌、致病大腸桿菌、痢疾桿菌、嗜水氣單胞菌和艱難梭菌等）；

 

病毒（HTLV、HIV、HBV、HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、輪狀病毒、細小病毒B19）；

 

寄生蟲（瘧疾等）；

 

人遺傳病（Lesh-Nyhan綜合癥、地貧、血友病、BMD、DMD、囊性纖維化等）免疫學：HLA分裂；

 

T細胞受體或抗體多樣化的定性；

 

自身免疫病基因作圖；

 

淋巴因子定量人類基因組工程：用散布重復序列產生DNA標志；

 

遺傳圖譜的構建（檢測DNA、多態性或精子繪圖）；

 

物理圖譜的構建；

 

測序，表達圖譜法醫：犯罪現場標本分析；

 

HLA-DQ腫瘤：胰癌、結腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、血液惡性腫瘤組織和群體生物學：遺傳聚類研究；

 

動物保護研究；

 

生態學；

 

環境科學；

 

實驗遺傳學。

 

古生物學：考古與博物館標本分析動物學：動物傳染病的診斷等植物學：檢測植物病原等

 

PCR的基本原理和概念基本原理DNA在細胞中的復制是—個比較復雜的過程。

 

參與復制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發酶合成的RNA引物、核苷酸原料、無機離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結構的若干酶與蛋白質因子等。

 

PCR是在試管中進行DNA復制反應，基本原理與體內相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱（變性）、冷卻（退火、保溫（延伸）等改變溫度的辦法使DNA得以復制，反復進行變性、退火、延伸循環，就可使DNA無限擴增。

 

PCR的具體過程如下：將PCR反應體系升溫至95℃左右，雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈，此過程為變性。

 

然后將溫度降至引物的Km值以下，3'端與5'端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補區域結合，此過程稱為退火。

 

當將反應體系的溫度升至70℃左右時，耐熱的TaqDNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互補方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA鏈。

 

每一次循環使反應體系中的DNA分子數增加約一倍。

 

理論上循環幾次，就增加為2^n倍。

 

當經30次循環后，DNA產量達2^30拷貝，約為10^9個拷貝。

 

PCR擴增過程見圖8-1。

 

由于實際上擴增效率達不到2倍，因而應為（1 R）^n，R為擴增效率。

 

參與PCR反應體系的因素及其作用參與PCR反應的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、緩沖液、Mg2 、三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、反應溫度與循環次數、PCR儀等。

 

現對它們的作用介紹如下：（一）模板核酸用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。

 

當用RNA作模板時，首先要進行反轉錄生成cDNA，然后再進行正常的PCR循環。

 

核酸模板來源廣泛，可以從培養細胞、細菌、病毒、組織、病理標本、考古標本等中提取。

 

PCR反應時加入的DNA模板量一般為100-100000拷貝，現在的技術水平已能從單個細胞制備出相應的cDNA文庫。

 

DNA模板含量合適，可以減少PCR多次循環帶來的堿基錯配。

 

通常模板DNA用線性DNA分子，若為環狀質粒，最好先用酶將其切開成線狀分子，因為環狀DNA復性太快。

 

（二）引物引物決定PCR擴增產物的特異性與長度。

 

因此，引物設計決定PCR反應的成敗。

 

PCR反應中有兩種引物，即5'端引物與3'端引物。

 

5'端引物是指與模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指與模板3'端序列互補的寡核苷酸。

 

對引物的基本要求有：①引物的長度過短會影響PCR的特異性，要求有16-30bp，因為4^16=4.29x10^9，已大于哺乳動物基因組3x10^9bp，保證了特異性結合；

 

引物過長使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74度），亦會影響產物的特異性。

 

②G C的含量一般為40％-60％。

 

③四種堿基應隨機分布，不要有連續3個以上的相同嘌吟或嘧啶存在。

 

尤其是引物3'端，不應有連續3個G或c，否則會使引物與核酸的G或c富集區錯誤互補，而影響PCR的特異性。

 

④引物自身不應存在互補序列而引起自身折疊，起碼引物自身連續互補堿基不能大于3bp。

 

⑤兩引物之間不應互補，尤其是它們的3'端不應互補。

 

一對引物之間不應多于4個連續堿基有互補性，以免產生引物二聚體。

 

④引物與非特異靶區之間的同源性不要超過70％或有連續8個互補堿基同源，否則導致非特異性擴增。

 

①引物3'端是引發延伸的點。

 

因此不應錯配。

 

由于ATCG引起錯配有一定規律，以引物3'端A影響最大，因此，盡量避免在引物3'端第一位堿基是A。

 

引物3'端也不要是編碼密碼子的第三個堿基，以免因為密碼子第3位簡并性而影響擴增特異性。

 

⑧引物5'端可以修飾，包括加酶切位點，用生物素、熒光物質、地高辛等標記，引入突變位點，引入啟動子序列，引入蛋白質結合DNA序列等，引物的設計最好以電腦軟件進行指導。

 

反應體系中，引物濃度一般要求在O.1-0.5μmol之間。

 

濃度太高，容易生成引物二聚體，或非特異性產物。

 

引物Tm值與退火溫度有關，計算公式為：Tm=4（G C） 2（A T）。

 

引物Tm值最好在55-80℃范圍，以接近72℃為最好。

 

（三）耐熱的TaqDNA聚合酶1976年Chien分離出熱穩定聚合酶，1986年Erlich分離并純化了適于PCR的Tq熱穩定性聚合酶，為PCR成為實用技術奠定了基礎，現已用基因重組生產。

 

日前可用于PCR的聚合酶有多種：有從水生棲熱菌中提取的Taq酶、從嗜熱棲熱苗中獲得的Taq酶、從Litoralis棲熱球菌中分離的VENT酶、及從酸熱浴硫化裂片苗中分離的Sac酶，而以Taq酶用得最廣泛。

 

TaqDNA聚合酶分子量為94kD，75℃時酶比活性為150bs/酶分子，反應溫度過高或過低均影響其延伸率，Taq蕾有很高的耐熱穩定性。

 

實驗表明，在92.5℃、95℃、97.5℃時，其半衰期分別為40min、30min和5min。

 

純化的Taq酶在體外無3'-5'外切酶活性，因而無校正閱讀功能，在擴增過程可引起錯配。

 

錯配堿基的數量受溫度、Mg2 濃度和循環次數的影響。

 

通常，30次循環Taq酶的錯配率約為0.25％，高于Klenow酶的錯配率。

 

Taq酶在每一次循環中產生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。

 

應用低濃度的dNTP（各20μmol／L）、1.5mmol/L的Mg2 濃度、高于55℃的復性溫度，可提高Taq酶的忠實性，此時的平均錯配率僅為5x10^-6次/（核苷酸*循環）。

 

Taq酶具有類似于末端轉移酶的TdT的活性，可在新生成的雙鏈產物的3'端加上—個堿基，尤其是dATP最容易加上。

 

因此，欲將PCR產物克隆到載體上，可以用兩種處理辦法：一是構建dT-載體；

 

二是用Klenow酶將3'端的A去掉，即在PCR反應后，先在99℃加熱10min滅活Taq酶，調整Mg2 濃度至5-10mmol/L，加入1-2UKlenow片段，室溫下作用15-20min，3'端的A即被切去，Taq酶還具有反轉錄活性。

 

在2-3mmol/LMg2 濃度下68℃時出現類似反轉錄酶的活性。

 

若有Mg2 存在，則反轉錄活性更佳，利用這一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的擴增。

 

以往用Taq酶進行PCR擴增，一般只能擴增小于400bp的DNA片段，經過對酶的結構與功能的改造，以及PCR方法學的改進，現已能擴增20kb以上的DNA分于。

 

Taq酶在PCR反應中加入的量也很重要，太少當然不好，太多一方面浪費，同時也導致非特異性擴增，通常每lOOμl反應液中含1-2.5UTaq酶為好。

 

最好在0.5-5U范圍內確定最佳酶濃度。

 

另一個問題是，雖然Taq酶是熱穩定性較好的工具酶，也應注意在-20℃貯存。

 

（四）緩沖液緩沖液提供PCR反應合適的酸堿度與某些離子，常用10-50mmol/L。

 

Tris-HCI（pH8.3-8.8）緩沖液。

 

緩沖液中含有50mmol/LKCl有利于引物的退火。

 

有人并加入小牛血清白蛋白（100μg/L）或明膠（0.0％）或Twen20（0.05％-0.1％）或二硫基蘇糖醇（DDT，5mmol/L）等，認為這些物質可以保護Taq酶。

 

（五）Mg2 Taq酶的活性需要Mg2 。

 

Mg2 濃度過低，Taq酶活力顯暑降低；

 

Mg2 濃度過高，又使酶催化非特異性擴增。

 

Mg2 濃度還影響引物的退火、模板與PCR產物的解鏈溫度、引物二聚體的生成等。

 

Taq酶的活性只與游離的Mg2 濃度有關，而PCR反應體系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基團均可與Mg2 結合而降低Mg2 的游離濃度。

 

因此，Mg2 的總量應比dNTP的濃度高0.2-0.25mmol/L。

 

如果反應體系中含有EDTA等螯合劑，也可結合掉一部分Mg2 。

 

為了獲得Mg2 的最佳濃度，可用下面的優化法。

 

首先在PCR緩沖液小不加入Mg2 ，從配置的10mmol/L的Mg2 儲存液中取一定量加入到各反應管中，開始以0.5mmol/L的濃度梯度遞增（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L），由PCR反應后的電泳結果可確定Mg2 大概濃度范圍，再在該濃度的上下以0.2mmol/L遞增與遞減幾個濃度來精確確定Mg2 最適濃度。

 

（六）dNTPdNTP為PCR反應的合成原料。

 

每種dNTP濃度應相等，通常的濃度范圍為20-200gmol/L，在此范圍內，PCR產物的量、反應的特異性與忠實性之間的平衡最佳。

 

例如，當每種dNTP為20μmol/L時，理論上可以產生2.6μg的400bp的DNA。

 

使四種dNTP的濃度保持在其Km值（10-15μmol/L）以上，可保持堿基摻入的忠實性；

 

若dNTP的濃度大于50mmol/L，則可抑制Taq酶的活性。

 

（七）反應溫度和循環次數1．變性溫度與時間PCR反應中變性這一步很重要，若不能使模板DNA和PCR產物完全變性，PCR反應就不能成功，DNA分子中G C含量愈多，要求的變性溫度愈高。

 

太高的變性溫度和時間又會影響Taq酶的活性，通常的變性溫度和時間分別為95℃、30s，有時用97℃、15s。

 

雖然DNA鏈在變性溫度時兩鏈分離只需幾秒鐘，但反應管內部達到所需溫度還需要一定的時間，團此要適當延長時間。

 

為了保證模板DNA能徹底變性．最好為7-10min，然后在以后的循環中，將變性步驟設為95℃/min。

 

擴增100-300bp短片段時，還呵以用快速的兩步PCR法，即變性（94-97℃）、退火及延長（55-75℃）。

 

為防止在變性溫度時反應液的蒸發，可在反應管內加入1-2滴液體石蠟。

 

2．復性溫度和時間復性溫度決定PCR的特異性，合適的復性溫度應低于引物Tm值的5℃。

 

退火溫度過低，引起非特異性擴增；

 

增高退火溫度，可提高擴增的特異性，因此要嚴格規定退火溫度。

 

退火反應時間一般為1min。

 

在PCR開始的頭一次循環時，反應從遠低于Tm值的溫度開溫，由于Taq酶在低溫時仍具有活性，這時就可能因引物與模板非特異性配對面出現非特異性產物或出現引物二聚體然后在以后整個PCR反應中，非特異性產物反復擴增，而使PCR嚴重失敗。

 

為了盡量消除這種非特異性擴增，可以使用熱起動的方式，熱起動方法有幾種：一種方法是在PCR系統中加入抗Taq酶抗體。

 

抗體與Taq酶結合，使Taq酶活性受抑制。

 

因此在開始時，雖然溫度低，引物可與與模板錯配，但因Taq酶沒有活性，不會引起非特異性擴增；

 

當進行熱變性時，抗體在高溫時失活，Taq酶被釋放，就可發揮作用，在以后的延伸步驟進行特異的DNA聚合反應。

 

另一種熱起動法是用石蠟將Taq酶與PCR反應系統分隔，因此一開始在室溫條件下也沒有非特異性擴增。

 

當升溫到熱變性溫度下，石蠟熔化，Taq酶與PCR反面系統混合，從而在以后的步驟中發揮作用。

 

使用熱起動可以提高PCR擴增的特異性。

 

3．延伸溫度與時間延伸溫度一般為72℃左右，此時Taq酶活性為每秒鐘摻入核苷酸35-100個，2kb的片段用1min已足夠，若DNA片段較長，擴增時間可適當延長。

 

延伸時間過長又可引起非特異性擴增。

 

4．循環次數循環次數主要取決于最初靶分子的濃度，例如在初始靶分子為3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷貝數時，循環數可分別為25-30、30-35、35-40從40-45。

 

過多的循環次數會增加非特異性產物量及堿基錯配數。

 

PCR反應后期，擴增產物的增加并不成為指數方式，稱為平臺效應。

 

平臺效應可能與下列因素有關：dNTP與引物濃度降低，酶對模板的比例相對降低，多次循環后酶活力降低，產物濃度增高后變性不完全而影響引物延伸。

 

（八）PCR儀有多種進口與國產PCR儀。

 

儀器的升降溫方式可有氣體加溫、水加溫及電熱塊加溫等。

 

溫度、循環次數及時間等參數現多用電腦控制。

 

可根據需要選擇儀器。

 

由于PCR方法高度靈敏，少量的靶分子即可擴增至無限數。

 

因此要防止PCR擴增產物污染環境而引起以后的PCR假陽性。

 

為此，應將PCR儀及PCR產物檢測等過程與標本制備及PCR反應管的制備盡量在空間分開，最好在不同的房間進行。

 

通常可將實驗空間分為標本處理區、反應混合制備和PCR擴增區、產物分析區等。

 

聚合酶鏈式反應檢查

 

聚合酶鏈式反應是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。

 

PCR技術類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

 

聚合酶鏈式反應正常值體內菌群的種類和比例正常，人體處于動態平衡健康狀態。

 

聚合酶鏈式反應臨床意義PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。

 

因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領域。

 

異常結果：各種疾病所致的異常，例如梅毒。

 

①一期梅毒。

 

即硬下疳，潛伏期2～4周，外生殖器部位發生暗紅色硬腫塊、淺潰瘍，有軟骨樣硬度，周圍淋巴結腫大。

 

②二期梅毒。

 

在一期梅毒1～2個月之后，全身皮膚、粘膜發生對稱泛發皮疹、斑疹、丘疹、膿皰疹等。

 

粘膜可發生粘膜斑、扁平濕疣，傳染性強。

 

③三期梅毒。

 

發生在感染后2～3年乃至10年，皮膚為樹膠樣腫，還可涉及骨、關節、心、血管，表現為主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等，侵及神經為脊髓癆，全身麻痹（麻痹性癡呆）等等。

 

需要檢查的人群：疑似某種特定的疾病病人，進行分子特異性檢查。

 

引用：http://big5.wiki8.com/PCR_47830/