【醫學百科●全國狂犬病監測方案】

楊籍富

【醫學百科●全國狂犬病監測方案】

 

拼音

 

quánguókuángquǎnbìngjiāncèfāngàn

全國狂犬病監測方案（試行）

 

一、概述狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病，按《中華人民共和國傳染病防治法》的規定為乙類傳染病。

 

許多種類的哺乳動物都與狂犬病的傳播有關，犬是發展中國家人狂犬病最主要的儲存宿主和傳播宿主。

 

人感染狂犬病最常見的方式是通過感染狂犬病毒的犬、貓、野生食肉動物以及食蟲和吸血蝙蝠的咬傷、撓抓、舔舐皮膚或粘膜破損處而感染。

 

狂犬病毒主要通過破損的皮膚或粘膜侵入人體，經神經末梢上行進入中樞神經系統，臨床表現主要為急性、進行性、幾乎不可逆轉的腦脊髓炎，病死率100％。

 

狂犬病在世界范圍內廣泛分布。

 

據1999年世界狂犬病調查報告，145個國家和地區中僅有45個無狂犬病報告。

 

近年來，我國狂犬病疫情一直呈上升趨勢，病死數居我國37種法定報告傳染病首位。

 

1996年全國報告狂犬病發病數曾一度較低，為159例，而2004年全國狂犬病報告發病數上升至2660例，與2003年同期相比上升30.58%。

 

2004年狂犬病死亡人數占我國法定報告傳染病總死亡構成的35.72%。

 

我國的廣西、湖南、江蘇、安徽、湖北、廣東和貴州等省份近年來疫情持續上升，疫情形勢十分嚴峻。

 

因此，建立全國狂犬病監測系統，在狂犬病多發地區開展監測，分析狂犬病流行因素、掌握狂犬病的疫情特點與流行趨勢，對于狂犬病的預防和控制具有重要的意義。

 

二、監測目的（一）掌握我國狂犬病的疫情動態和流行規律，分析流行因素，為制定有效的預防控制措施提供科學依據。

 

（二）了解狂犬病暴露后預防處置現狀，評價預防處置效果，為進一步規范暴露后預防處置提供依據。

 

三、監測定義（一）病例定義根據流行病學史、臨床癥狀和實驗室檢測結果三項指標確定病例的定義。

 

1、流行病學史有被犬、貓或其他宿主動物舔、咬史。

 

2、臨床癥狀（1）愈合的咬傷傷口或周圍感覺異常、麻木發癢、刺痛或蟻走感。

 

出現興奮、煩躁、恐懼，對外界刺激如風、水、光、聲等異常敏感。

 

（2）“恐水”癥狀，伴交感神經興奮性亢進（流涎、多汗、心律快、血壓增高），繼而肌肉癱瘓或顱神經癱瘓（失音、失語、心律不齊）。

 

3、實驗室檢測（1）免疫熒光抗體法檢測抗原：發病第一周內取唾液、鼻咽洗液或腦脊液涂片、角膜印片、皮膚切片，用抗狂犬病熒光抗體染色，狂犬病病毒抗原陽性。

 

（2）RT-PCR方法檢測病毒核酸：發病第一周內取唾液、鼻咽洗液、腦脊液、角膜或皮膚組織，用RT-PCR方法檢測狂犬病毒核酸陽性。

 

（3）死后腦組織標本分離病毒陽性或印片熒光抗體染色陽性、腦組織內檢到內基氏小體或RT-PCR方法檢測腦組織標本中病毒核酸陽性。

 

4、病例分類（1）狂犬病疑似病例:指各級醫療單位臨床醫生上報的具有狂犬病臨床表現，而難以確診為狂犬病的病例。

 

（2）臨床診斷病例：流行病學史加上臨床表現的任意一條。

 

（3）確診病例：臨床診斷病例加上實驗室檢測的任意一條。

 

（二）狂犬病暴露者定義狂犬病暴露者指被狂犬、疑似狂犬或狂犬病宿主動物抓傷、咬傷、舔舐皮膚或粘膜破損處的所有人員。

 

四、監測內容(一)全國常規監測1.病例的發現與報告按照《中華人民共和國傳染病防治法》和《傳染病疫情報告管理規范》，各級各類醫療機構、疾病預防控制機構和衛生檢疫機構執行職務的醫務人員發現疑似、臨床診斷或實驗室確診病例應在診斷后24小時內填寫報告卡進行網絡直報。

 

不具備網絡直報條件的應在診斷后24小時內向相應單位送（寄）出傳染病報告卡，縣級疾病預防控制中心（以下簡稱疾控中心）和具備條件的鄉鎮衛生院收到傳染病報告卡后立即進行網絡直報。

 

2.病例個案調查縣級疾控中心接到狂犬病例報告后，應及時對病例進行流行病學調查，調查內容見《狂犬病病例個案調查表》（附表1）。

 

(二)監測點監測1.監測點的選擇原則（1）在近五年疫情持續高發的省，選取高發縣區作為國家級監測點；

 

（2）監測點具有一定的狂犬病防制工作基礎，能夠承擔并完成監測任務；

 

（3）監測點的確定：在近年來疫情持續高發的廣西、湖南、安徽、貴州4省，選擇高發地市或縣區作為國家監測點。

 

2.監測內容（1）常規疫情監測①病例的發現與報告同全國常規監測。

 

②病例個案調查監測點所在的縣級疾控中心接到狂犬病病例報告后，應對所有病例進行個案調查，填寫《狂犬病病例個案調查表》（附表1）。

 

（2）實驗室監測①標本采集、保存和送檢：嚴格按照《狂犬病標本采集技術指南》（見附件1）要求，采集監測點報告的所有臨床診斷病例的唾液、腦脊液、尿液、鼻咽洗液、皮膚組織或病死者腦組織等標本，送至省級疾控中心進行檢測（送檢表見附表2《狂犬病人標本送檢登記表》）。

 

②標本檢測：省級疾控中心負責本省監測點標本的實驗室檢測，采用RT-PCR方法檢測狂犬病毒特異性核酸，采用免疫熒光法或酶聯免疫吸附實驗檢測狂犬病毒抗原，對病毒抗原和核酸陽性的標本進行病毒核酸測序和分析。

 

詳細操作過程見《狂犬病實驗室檢測技術指南》（附件2）。

 

③結果鑒定：各省疾控中心將核酸測序和分析結果上報至國家疾控中心進行鑒定和分析。

 

④實驗室檢測結果的匯總、反饋：省疾控中心每季度末將本季度檢測結果匯總并反饋到各監測點，國家疾控中心接到標本后一個月之內將鑒定結果向各省反饋。

 

（3）狂犬病暴露后預防處置情況監測各監測點選擇1所縣區級疾控中心預防門診、1所縣及縣以上綜合醫院和1所高發鄉的衛生院進行狂犬病暴露后預防處置情況監測，由診治大夫負責填寫《狂犬病暴露人群門診登記表》（附表4），收集前來就診的所有狂犬病暴露者的預防處置相關信息。

 

（4）宿主動物監測監測點所在地的疾控中心通過當地畜牧、獸醫、公安等相關部門調查、了解所轄地區的犬等宿主動物情況，包括犬和其它有關動物的數量、種類和免疫覆蓋等情況（調查表見附表5）。

 

在可能情況下，對犬及其他宿主動物進行帶毒情況調查。

 

五、數據收集、分析、反饋（一）數據收集1.狂犬病疫情法定報告信息各級各類醫療機構、疾病預防控制機構和衛生檢疫機構執行職務的醫務人員按照《中華人民共和國傳染病防治法》和《傳染病疫情與突發公共衛生事件報告管理規范》的相關規定，對狂犬病病例進行報告。

 

2.狂犬病病例個案信息縣級疾控中心指定專人負責收集狂犬病病例個案信息，于每月10日以前將上月所有個案調查表錄入狂犬病監測數據庫，并上報省級疾控中心。

 

省級疾控中心每月20日前將本省上月的狂犬病監測數據上報中國疾控中心。

 

3.狂犬病實驗室監測信息省級疾控中心負責收集、匯總轄區內狂犬病實驗室檢測結果，每季度末將本季度的結果錄入狂犬病監測數據庫，上報中國疾控中心。

 

4.狂犬病暴露者門診匯總數據監測點所在的縣級疾控中心負責收集轄區內狂犬病門診的《狂犬病暴露人群門診登記表》（附表4），于每月10日前進行匯總并將匯總結果錄入狂犬病監測數據庫，報告上級疾控中心。

 

5.狂犬病宿主動物基本情況調查數據監測點所在的縣級疾控中心負責收集轄區內狂犬病宿主動物的基本情況，每年1月15日將上年的《狂犬病宿主動物基本情況調查表》（附表5）的內容錄入狂犬病監測數據庫，并將數據報告上級疾控中心，各省疾控中心負責收集省內所有狂犬病監測點的數據，并于每年2月15日前上報上年監測數據。

 

（二）數據質量控制1.方法和標準的統一（1）各項調查內容均使用統一調查表和調查方法；

 

（2）使用指定的實驗室檢測方法和檢測試劑進行標本檢測。

 

2．數據庫建立的質量控制（1）使用統一的數據庫錄入數據；

 

（2）通過設計計算機軟件來識辨調查表邏輯錯誤，減少錄入錯誤；

 

（3）通過人工抽查核對，發現非邏輯錯誤。

 

（三）資料分析各級疾控中心每季度、每年對狂犬病監測資料進行分析，也可根據需要不定期地進行分析。

 

1.病例的三間分布從時間、地區、人群分布分析狂犬病的發病死亡特點。

 

2.病例的暴露情況分析對致傷動物的種類、病例的傷口狀況、預防處置情況等進行分析。

 

3.暴露人群治療處置情況分析對狂犬病暴露人群的特點，以及傷口處理、預防接種等情況進行分析。

 

4.狂犬病宿主動物分析對監測點狂犬病宿主動物的數量、密度、免疫情況以及不同傷人動物的情況進行分析。

 

5.狂犬病病原學檢測結果分析分析狂犬病病原學及其遺傳變異情況。

 

6.流行因素分析綜合監測結果及當地收集到的相關信息對狂犬病的流行因素進行綜合分析。

 

（四）信息交流和反饋各級疾控中心應由專人負責監測工作，定期將有關監測報告、統計分析和季度、年度總結以E-Mail、傳真或信函的形式報上級疾控部門和同級衛生行政部門。

 

上級疾控部門接到報告后，應及時對分析結果進行反饋（以文件、信函、督導等方式）。

 

各監測點應定期將監測結果向鄰近的地區及相關部門（如畜牧獸醫部門）進行通報。

 

六、監測系統的組成和職責（一）衛生行政部門衛生部領導和組織協調全國狂犬病監測工作，各級衛生行政部門負責組織開展本轄區內狂犬病監測工作，并提供所需的監測經費，保證監測工作的順利開展。

 

（二）疾病預防控制機構1.中國疾病預防控制中心（1）組織監測方案的起草、論證和完善，為全國狂犬病監測提供技術指導。

 

（2）組織對全國各省級疾控中心和國家級監測點專業技術人員的培訓。

 

（3）負責全國監測數據的收集、整理，定期對數據進行分析、反饋。

 

（4）負責狂犬病診斷試劑的標準化及各級網絡實驗室的質量控制。

 

（5）負責各省分離的狂犬病病毒的實驗室鑒定工作。

 

（6）負責組織專家定期對全國狂犬病監測系統進行督導、評價。

 

（7）每年組織召開全國狂犬病監測年度工作總結研討會。

 

2.省級疾控中心（1）根據全國監測方案，起草本省的監測實施方案，并組織實施。

 

（2）有效組織實施本省的常規監測工作。

 

（3）組織對市級疾控中心和國家級監測點的專業技術人員的培訓與指導。

 

（4）定期收集監測數據，并進行分析、反饋。

 

（5）定期對本省的監測工作進行督導與評價。

 

（6）每年對本省狂犬病監測工作進行年度總結。

 

3.市級疾控中心（1）有效組織實施本市的常規監測工作。

 

（2）指導本市國家級監測點的監測工作。

 

（3）定期收集監測數據，并進行分析、反饋。

 

（4）定期對本市的監測工作進行督導、質量控制與評價。

 

（5）每年對本市狂犬病監測系統進行年度工作總結。

 

4.縣級疾控中心（1）根據全國監測方案和省級的監測實施方案的要求，遂項落實各項監測工作。

 

（2）接受上級疾控中心技術的培訓與指導，規范各項監測工作。

 

（3）安排專人定期收集、整理、匯總和上報監測數據。

 

（4）定期對監測工作進行質量控制與評價。

 

（5）每年對本地狂犬病監測工作進行年度工作總結。

 

（三）醫療機構各級各類醫療機構負責狂犬病病例的發現及報告工作，協助縣、區級疾病預防控制中心進行流行病學調查及標本采集工作。

 

對醫護人員進行業務培訓，尤其是傳染病防治法及相關知識的培訓。

 

七、保障工作（一）組織保障1.狂犬病監測應納入當地疾控中心日常工作。

 

2.各級疾控中心應明確一名業務領導負責監測工作。

 

3.承擔監測任務的各級疾控中心應指定責任心強、業務能力強的專業技術人員具體實施監測工作。

 

4.參加監測工作的各單位應加強相關業務人員的培訓。

 

（二）經費保障1.為保障監測工作的順利進行，國家為監測點提供一定的監測啟動經費。

 

2.監測點所在的省、市、縣應提供監測配套經費。

 

3.監測經費必須實行專款專用。

 

（三）物資保障承擔監測任務的各級疾控中心和醫療機構應保證監測所需的各種物資和技術支持。

 

由中國疾控中心統一提供監測點檢測試劑。

 

（四）質量控制1.每年組織監測工作的質量評價。

 

2.每年根據監測點疫情變化，對監測點和監測工作計劃進行必要的調整。

 

八、附件附表1狂犬病病例個案調查表縣（市）名稱：國標碼：□□□□□□病例編號：□□□□□1、一般情況1.1姓名：1.2性別：□1男□2女1.3年齡：歲1.4職業：□1農民□2工人□3學生□4散童□5其它1.5詳細住址：省（自治區、直轄市）市（地區）縣（區）鄉（鎮、街道）村（居委會）組（門牌號）2、暴露（被傷）及傷口處理情況2.1暴露（被傷）日期：年月日時2.2暴露詳細地址：省（自治區、直轄市）市（地區）縣（區）鄉（鎮、街道）村（居委會）組（門牌號）2.3暴露方式:□1咬傷□2抓傷□3其它2.4暴露程度：□1Ⅰ度□2Ⅱ度□3Ⅲ度2.5暴露部位（可多選）：□1頭面□2頸部□3軀干□4手臂□5手部□6下肢膝以上□7下肢膝以下2.6傷口處理：□1未處理（轉至3）□2自行處理□3醫療機構處理2.6.1處理時間：年月日時2.6.2處理單位：□1村衛生室□2鄉鎮衛生院□3縣級及以上醫療機構□4其他2.6.3處理方式（可多選）：□1擠壓出血□2沖洗□3消毒□4傷口縫合□5其他3、預防注射3.1暴露免疫史：□1有（免疫時間年月日，免疫針次針），□2無3.2暴露后抗血清注射：□1有，□2無（轉至3.3）3.2.1種類：□1免疫球蛋白□2抗血清3.2.2注射時間：年月日3.2.3注射劑量：3.2.4有無過敏：□1有（過敏表現：）□2無3.3．暴露后人用狂犬病疫苗注射：□1有，□2無（轉至4）3.3.1注射單位：□1村衛生室□2鄉鎮衛生院□3縣級及以上醫療機構□4其他3.3.2種類：□1Vero□2地鼠腎3.3.3首針時間：年月日時，首針劑量：□1劑□2劑3.3.4免疫程序：□10-3-7-14-28□2其他3.3.5疫苗注射針次，如未全程，原因：3.3.6是否加強注射：□1是（加強針次：針），□2否3.3.7疫苗生產單位：，批號：，失效期：年月日4、臨床資料4.1發病時間：年月日4.2死亡時間：年月日4.3診斷單位：□1村衛生室□2鄉鎮衛生院□3縣級及以上醫療機構□4其他4.4發病臨床癥狀（可多選）：□1煩躁□2恐水□3怕風□4畏光□5抽搐□6精神失常5、實驗室檢測5.1采樣時間：年月日5.2標本種類：□1唾液□2腦脊液□3尿液□4鼻咽洗液5.3檢測項目：□1病原檢測□2核酸檢測5.4檢測結果：□1陽性□2陰性6、傷人動物情況6.1動物種類：□1狗□2貓□3其它6.2傷人動物來源：□1自家養□2鄰居養□3流浪動物□4野生動物□5其它6.3若為家養動物，是否接種獸用狂犬病疫苗：□1是（接種日期：年月日），□2否6.4動物傷人原因：□1主動襲擊□2自衛傷人□3嘻逗□4其他6.5.是否同時咬傷多人：□1是，□2否6.6傷人后：□1如常（轉至7）□2打死□3失蹤□4病死□5宰殺□6其他6.6.1死亡時間：年月日6.6.2動物死后處理方式：□1焚燒□2深埋□3出售□4丟棄□5屠宰剝皮□6烹食□7其‘它7、如為一犬傷多人7.1共傷人7.2本例為第例次7.3共死亡_____人被調查人與患者關系：調查人簽名：調查人單位：調查日期：年月日填表說明1．在所選項目前的“□”中，劃“∨”作為選擇答案，若無特殊說明，所有選項均為單選。

 

凡有“”的選項，須填寫相應內容；

 

2．病例編號填寫規定：年號（兩位數）、流水號（后邊三位）3．“2.4暴露程度”參照WHO建議分類標準分為以下三類：Ⅰ度：被犬舔過無開放性傷口的健康皮膚和粘膜；

 

Ⅱ度：裸露的皮膚或粘膜被輕輕咬過，表面劃傷，但沒有破口；

 

Ⅲ度：任何部位的皮膚或粘膜，一處或多處被咬破或抓穿。

 

附表2狂犬病人標本送檢登記表附表3狂犬病病原學檢測結果登記表附表4狂犬病暴露人群門診登記表填表說明:1暴露分級分為三類：Ⅰ度：被犬舔過無開放性傷口的健康皮膚和粘膜；

 

Ⅱ度：裸露的皮膚或粘膜被輕輕咬過，表面劃傷，但沒有破口；

 

Ⅲ度：任何部位的皮膚或粘膜，一處或多處被咬破或抓穿。

 

2．傷人動物種類:可分為瘋動物、可疑瘋動物、正常動物（家養、無主動物、野生動物）、不知道等附表5狂犬病宿主動物基本情況調查表

 

附件1狂犬病標本采集技術指南1、采集標本者個人安全防護（1）從事標本采集和運送的工作人員均要經過專門培訓方可進行此項工作。

 

（2）從事標本采集和運送的工作人員均要進行暴露前免疫。

 

（3）采集標本前要穿戴好防護服裝、眼鏡、手套，作好技術上的準備。

 

2、采集標本的包裝：要求使用符合生物安全標準的包裝盒盛放標本。

 

3、采集標本的時間、類型和存放（1）在狂犬病病人入院后，盡可能早期采集標本。

 

（2）用于病原學檢測的標本：病人唾液、腦脊液、尿液、鼻咽洗液、咬傷處皮膚組織或病人死后的眼角膜、腦組織等均可用于病毒的檢測和分離。

 

以腦組織陽性率最高。

 

（3）用于抗體檢測的標本：無菌采集病例或免疫后血液2～3ml，分離血清后用于狂犬病特異性抗體的檢測。

 

（4）標本的存放a)用于病毒檢測和分離的標本在－20℃或－20℃以下低溫（－70℃）、液氮、或放在含50％甘油的PBS中以保持標本的感染性，應將標本盛于無菌容器內，放在密封的盒內并注明其危險性以防病毒的擴散。

 

b)標本要求無菌采集，－20℃保存待檢。

 

4、采集標本的運送用于病毒檢測和分離的標本，應帶冰、干冰或液氮條件下盡快運送至實驗室。

 

5、采集標本的保存負責標本接收和檢測的實驗室，接到標本以后若暫時不檢測，應立即冷凍保存。

 

用于病毒檢測和分離的標本可以在－70℃長期保存，沒有條件的也可以在－20℃條件下短期保存。

 

6、標本的檢測和結果反饋程序病例調查及標本縣CDC實驗室：標本處理，病例調查省級CDC實驗室：檢測國家CDC：疑難病例、分離毒株。

 

附件2狂犬病實驗室檢測技術指南1、實驗室條件及生物安全操作要求（1）從事狂犬病臨床和實驗室的工作人員需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒時必需立即報告本部門負責人。

 

（2）操作所有潛在狂犬病感染的材料均應在P2或P3（實驗室固定毒在P2，病人或動物分離的街毒在P3）生物安全實驗室內進行。

 

（3）當實驗室對接收到的動物標本進行操作時，必須在P3以上條件的專業實驗室中進行。

 

沒有安全實驗室（P3級）的單位，嚴禁從事病毒分離工作。

 

（4）實驗前要穿戴好防護服裝、眼鏡、手套，作好技術上的準備。

 

（5）由于空氣傳播狂犬病毒已經得到證實，因此高速混懸或離心操作應在密閉狀態下進行。

 

（6）實驗后要作好善后消毒處理,狂犬病毒對脂溶劑（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制劑和四銨化合物敏感，操作完畢對操作臺、實驗材料等要用相應的消毒劑或高壓蒸汽進行消毒處理。

 

2、實驗室檢測網絡組成及職責（1）中國疾病預防控制中心牽頭，全國各省級疾病預防控制中心及所轄區域內的各級疾病預防控制中心組成實驗室檢測網絡。

 

（2）中國疾病預防控制中心職責A.診斷試劑的研制、標準化，并推薦質量穩定可靠的診斷試劑；

 

B.負責毒株的鑒定和病毒變異性調查；

 

C.對各級實驗室檢測人員進行技術培訓。

 

D.協助省級疾病預防控制中心完成標本的實驗室檢測。

 

（3）省級疾病預防控制中心職責A.收集、保存轄區內各監測點的各種待檢測標本。

 

B.轄區內各種標本的實驗室檢測。

 

C.對本省監測點標本采集和運送給與技術指導和協助。

 

（4）縣級監測點疾病預防控制中心職責采集病例標本，運送病例標本至省級疾病預防控制中心。

 

3、實驗室檢測方法（1）病原檢測：A.免疫熒光法檢測抗原：病人的腦脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬傷部位皮膚組織或腦組織印片或冷凍切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特異性熒光抗體染色檢測狂犬病毒抗原。

 

B.快速狂犬病酶聯免疫吸附法檢測抗原：用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋的抗狂犬病毒核衣殼IgG包被96孔酶標板，4℃過夜；

 

用含0.3％牛血清白蛋白和5%蔗糖的pH9.6碳酸鹽緩沖液封閉30分鐘；

 

將采集到的標本研磨，用pH7.4PBS制成30％的懸液，離心取上清加入酶標板孔內，同時設陰性、陽性對照，200μl/孔，37℃孵育1小時；

 

洗板四次后加入純化的酶標記抗狂犬病毒抗體200μl/孔，37℃l小時后洗板，加入酶反應底物，室溫作用30分鐘，2MH2SO4終止反應，肉眼觀察或酶標儀測定結果。

 

（2）核酸檢測：RT-PCR方法：以特異性擴增核蛋白（N）基因最保守區域為目的基因，設計一對引物：N1（＋）：5’-587TTTGAGACTGCTCCTTTTG605-3’;N2（-）：5’-1092CCCATATAGCATCCTAC605-3。

 

唾液、腦脊液、皮膚或腦組織標本以及感染病毒后的細胞培養物或鼠腦均可用于病毒核酸的檢測。

 

基本步驟為：待檢標本用細胞總RNA分離試劑提取病毒RNA，再通過逆轉錄反應合成與目的基因RNA序列互補的cDNA，PCR循環特異性擴增目的基因cDNA，電泳檢測PCR擴增產物，判斷檢測結果。

 

（3）病毒分離：抗原或核酸檢測陽性標本可以進行病毒分離以便進行更深入的研究。

 

A.細胞培養法分離病毒：將唾液、腦脊液、皮膚或腦組織標本研磨后，用PBS或MEM制成30％懸液→4℃2000r/min離心20分鐘→取上清接種在96孔或24孔培養板內已形成單層的敏感細胞（鼠神經傳代細胞、Vero細胞或BHK21細胞）上,吸附2小時后補加含2%血清的維持液，37℃5％C02孵育約4～5天，丙酮固定感染后的細胞，用抗狂犬病毒單克隆抗體觀察特異性熒光包涵體判斷結果。

 

陽性時吸取上清至一無菌容器內-70℃保存備用或繼續傳代。

 

病毒通過細胞的多次傳代可以適應細胞培養并得到擴增。

 

B.乳小白鼠接種法分離病毒：30％的病人或動物腦組織懸液，離心取上清，接種1～2日齡乳鼠腦內，每個樣品注射一窩乳鼠；

 

注射后的乳鼠應在具有高效濾過裝置的負壓飼養柜內飼養。

 

癥狀不典型時可于接種第一代后取腦繼續傳代，連續傳代后潛伏期逐漸規律，一般為5天左右。

 

發病乳鼠若確定為狂犬病毒感染，無菌取腦，-70℃或用含50％甘油的PBS-20℃保存，也可研磨后加滅菌脫脂牛奶制成20％懸液，真空冷凍干燥，長期保存。

 

未發病存活的鼠保留至21天后殺死作免疫熒光檢測(4)抗體檢測A.特異性抗體檢測：在自然感染情況下，狂犬病毒通常由被瘋動物咬傷時通過其帶有病毒的唾液進入機體傷口內，在入侵部位狂犬病毒基本上不增殖，一般也不侵入血流，故不能形成病毒血癥。

 

因此，在感染后的一段時間內狂犬病毒或其抗原不能與機體免疫系統廣泛接觸，不能有效刺激機體產生抗狂犬病毒感染的免疫應答反應。

 

狂犬病的晚期因血腦屏障作用被破壞，腦內大量病毒抗原得以進入血流，可以刺激機體的免疫系統產生大量特異性抗體。

 

因此，許多狂犬病人在發病早期血清中查不到抗體或抗體滴度很低，狂犬病特異性抗體只在臨床疾病的晚期出現。

 

B.中和抗體檢測：狂犬病疫苗免疫后血清中和抗體水平是測定疫苗免疫力程度的評判指標，WHO狂犬病專家委員會認為中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保護。

 

狂犬病毒中和抗體的檢測可以用傳統的小鼠中和試驗或WHO推薦的快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）。

 

RFFIT試驗時倍比稀釋已經滅活的血清樣品，同時設陰、陽性血清對照。

 

病毒用標準固定毒CVS株，細胞用BHK21細胞系。

 

首先將稀釋的被檢及對照血清0.1ml加入96孔細胞培養板中，再在各血清孔中加入0.1m1標準病毒稀釋液（100TCID50），37℃中和1.5小時；

 

然后每孔加入細胞，37℃、5�2培養過夜后棄掉培養液，PBS洗一次，丙酮固定。

 

干燥后，加熒光素標記的抗狂犬病毒抗體，37℃30分鐘，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察結果：比較實驗組和陰性血清組的熒光灶，實驗組中能使熒光灶抑制≥50％的血清最高稀釋倍數，即為被檢血清的中和抗體滴度。

 

引用：http://big5.wiki8.com/quanguokuangquanbingjiancefangan_48510/