【醫學百科●發光免疫技術】

楊籍富

【醫學百科●發光免疫技術】

 

拼音fāguāngmiǎnyìjìshù

發光免疫技術是將發光系統與免疫反應相結合，以檢測抗原或抗體的方法。

 

其既具有免疫反應的特異性，更兼有發光反應的高敏感性，在免疫學檢驗中應用日趨廣泛。

 

發光的基本知識一種物質由電子激發態回復到基態時，釋放出的能量表現為光的發射，稱為發光（luminescence）。

 

發光可分為三種類型：光照發光、生物發光和化學發光。

 

1．光照發光（photoluminescence）發光劑經短波長入射光照射后進入激發態，當回復至基態時發出較長波長的可見光（見第十七章）。

 

2．生物發光（bioluminescence）典型例子為螢火蟲發光。

 

反應底物為螢火蟲光素（fireflyluciferin），在熒光素酶（luciferase）的催化下利用ATP產能，生成激發態的氧化熒光素（oxyluciferin），后者在回復到基態時多余的能量以光子形式放出。

 

反應式如下：3．化學發光（chemiluminescence）在常溫下由化學反應產生的光的發射。

 

化學發光是一個多步驟的過程，其機制為某些化合物（發光劑或發光底物）可以利用一個化學反應產生的能量使其產物分子或反應中間態分子上升至電子激態。

 

當此產物分子或中間態分子衰退至基態時，以發射光子的形式釋放能量（即發光）。

 

化學發光底物在化學發光反應中參與能量轉移并最終以發射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學發光劑或發光底物。

 

在發光免疫技術中常用的化學發光底物有以下幾類。

 

1．氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學發光劑。

 

魯米諾（luminol，5＇-氨基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮）的分子結構及化學反應式如下：魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物。

 

異魯米諾衍生物ASEI和ABMI等也是常用的標記物。

 

2．吖啶酯（acridiniumester，AE）類這類發光劑不需催化劑的存在，在有過氧化氫的稀堿溶液中即能發光。

 

反應式如下：圖18-1電化學發光原理上式反應迅速，在1～5s內即可完成；

 

具有背景低、信比高的優點，其檢測極限可達5×10-9mol，發光量與AE濃度呈良好的線性反應，是一類的標記物。

 

3．電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）反應在電極表面進行。

 

發光底物為三聯吡啶釕[Ru（bpy）32 ]，另一反應物為三丙胺（TPA）。

 

在陽電極表面，以上兩化學物質可同時失去電子發生氧化反應（圖18-1）。

 

二價的Ru（bpy）32 被氧化成三價Ru（bpy）33 ，TPA被氧化成陽離子自由基TPA ●，后者失去一個質子（H ），成為自由基TPA●，這是一個強還原劑，可將一個電子遞給三價的Ru（bpy）32 *，而TPA自身被氧化成TPA氧化產物。

 

激發態的Ru（bpy）32 *在衰減時發射一個波長為620nm的光子，重新生成基態的Ru（bpy）32 。

 

這一過程在電極表面周而復始地進行，產生許多光子，使信號得以增強。

 

化學發光免疫測定化學發光反應參與的免疫測定分為二種類型。

 

第一種是以發光劑作為酶免疫測定的底物，通過發光反應增強測定的敏感性；

 

第二種是以發光劑作為抗體或抗原的標記物，直接通過發光反應檢測標本中抗原或抗體的含量。

 

化學發光酶免疫測定從標記免疫測定來看，化學發光酶免疫測定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA）應屬酶免疫測定。

 

測定中2次抗原抗體反應步驟均與酶免疫測定相同，僅最后一步酶反應所用底物為發光劑，通過化學發光反應發出的光在特定的儀器上進行測定。

 

兩種常用的標記酶，辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）均有其發光底物，由此建立的CLEIA均在臨床檢驗中應用。

 

HRP標記的CLEIA常用的底物為魯米諾或其衍生物。

 

魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/LpH8.6Tris緩沖液作底物液，魯米諾和H2O2在無HRP催化時也能緩慢自發發光，而在最后光強度測定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。

 

HRP催化魯米諾氧化的反應可被某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲熒光素酶等加強。

 

加強劑的作用是增強發光和延長發光時間，由此可提高敏感度。

 

AP標記的CLEIA在以AP為標記酶的CLEIA中，應用的底物為adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品試劑如PPD可供應用。

 

發光反應的反應式如下：化學發光標記免疫測定化學發光標記免疫測定亦稱化學發光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLIA），是用化學發光劑直接標記抗原或抗體的一類免疫測定方法。

 

用作標記的化學發光劑應符合以下幾個條件：①能參與化學發光反應；

 

②與抗原或抗體偶聯后能形成穩定的結合物試劑；

 

③偶聯后仍保留高的量子效應和反應動力；

 

④應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。

 

魯米諾類和吖啶酯類發光劑等均是常用的標記發光劑。

 

魯米諾類的發光反應須有催化劑（例如過氧化物酶）催化，且與蛋白質或肽結合后其發光作用減弱，因此魯米諾類在CLEIA中是很好的底物，但已較少用于CLIA的標記。

 

吖啶酯類對CLIA更為適用，其顯著的優點是：①氧化反應不需催化劑，只要堿性環境中就可以進行。

 

反應物在加入H2O2后再加氫化鈉溶液，發光反應迅速，本底低。

 

②在氧化反應過程中，結合物被分解，因此游離的吖啶酯的發光不受抑制。

 

試劑穩定性好。

 

電化學發光免疫測定在電化學發光免疫測定（electrochemluminescenceimmunoassay，ECLI）中應用的標記物為電化學發光反應的底物三聯吡啶釕，其衍生物N-羥基琥珀酰胺（NHS）酯可通過化學反應與抗體或不同化學結構的抗原分子結合，制成標記的抗體或抗原。

 

ECLI的測定模式與ELISA相似，分二個步驟進行。

 

以雙抗體夾心法測定抗原為例，第一步在試管中進行，反應物為Ru（bpy）32 標記的抗體、吸附在磁性微球上的固相抗體以及受檢的標本，反應式如圖18-2。

 

圖18-2ECLI中的抗原抗體反應反應后除由標記抗體、固相抗體與標本中的抗原形成的夾心復合物外，尚有多余的標記抗體和固相抗體。

 

第二步是將反應液輸入特殊的檢測儀器的反應室中（圖18-3），隨即用含三丙胺（TPA）的緩沖液沖洗。

 

反應室電極下有磁鐵。

 

含磁性微球的夾心復合物及游離的固相抗體被吸附在電極表面，游離的標記抗體隨沖洗液流出。

 

此時在反應室中即發生如圖18-1的電化學發光反應。

 

發出的光由光電倍增管轉為信號，通過電信號的測定反映標本中抗原的含量。

 

圖18-3ECLI中的ECL反應ECLI具有以下優點：①標記物在再循環利用，使發光時間更長、強度更高、易于測定；

 

②敏感度高，可達pg/ml或pmol水平；

 

③線性范圍寬，＞104；

 

④反應時間短，20min以內可完成測定；

 

⑤試劑穩定性好，2～5℃可保持一年以上。

 

發光免疫技術在醫學檢驗中的應用放射免疫分析因標記物的放射性在應用中存在不少問題。

 

為替代這一廣被采用的測定方法，近年來創立了多種新的標記免疫技術。

 

化學發光免疫測定具有明顯的優越性：①敏感度高，甚至超過RIA；

 

②精密度和準確性均可與RIA相比；

 

③試劑穩定，無毒害；

 

④測定耗時短；

 

⑤測定項目多；

 

⑥已發展成自動化測定系統。

 

因此化學發光免疫測定在醫學檢驗中不僅能取代RIA，而且可得到更為廣泛的應用。

 

 

引用：http://big5.wiki8.com/faguangmianyijishu_122674/