【醫學百科●石蠟切片】

楊籍富

【醫學百科●石蠟切片】

 

拼音

 

shílàqiēpiàn

 

英文參考

 

paraffinsection

 

器材切片刀，切片機，恒溫箱，溫臺，熔蠟爐，蠟杯，酒精燈，蠟鏟，展片臺，解剖刀，解剖針，解剖剪，解剖盤，培養皿，吸管，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤，樹膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計，臉盆，水浴鍋。

 

試劑卡諾氏固定液、FAA固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，郝普特氏粘片劑，中性樹膠。

 

1%番紅，1%固綠，1%過碘酸，Schiff試劑，0.5%偏重亞硫酸鈉溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。

 

材料鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、莖、葉等。

 

每個實驗小組的用量器材切片機，切片刀，溫臺，恒溫箱，熔蠟爐，水浴鍋等這類幾個小組用一臺就行；

 

解剖刀，單面刀片，小臺木，毛筆一只，蠟鏟一個，蓋玻片和載玻片30個，臉盆一個，酒精燈各一個，包埋紙盒2~3個，染色缸一個，瓷杯3個，顯微鏡一臺。

 

試劑FAA固定液50ml、1%番紅100ml、1%固綠100ml、1%過碘酸100ml、Schiff試劑100ml、亞硫酸鹽300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%淀粉糖化酶溶液200ml，石蠟半盒、蜂蠟10塊、埃利希蘇木精染液100ml、1%伊紅酒精溶液100ml、1%鹽酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片劑數滴，中性樹膠數滴。

 

材料小白鼠一只、蠶豆種，小麥和大豆種10~20粒，洋蔥和大蒜由實驗室統一種，然后取其所需部分。

 

石蠟切片法實例（一）—蘇木精-伊紅對染法目的要求1、熟悉石蠟切片的制作過程。

 

2、掌握HE染色的基本原理和染色方法。

 

實驗原理石蠟切片是最基本的切片技術，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。

 

蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。

 

這種方法適用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。

 

經過HE染色，細胞核被蘇木素染成藍紫色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

 

實驗用品（一）器材切片機，切片刀，溫臺，恒溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小臺木，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。

 

（二）試劑卡諾（Carnoy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸乙醇液，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。

 

試劑配法：1、卡諾氏固定液：100%酒精3份冰醋酸1份或：100%酒精6份氯仿3份冰醋酸1份2、埃利希蘇木精染液的配法：蘇木精1g純酒精50ml冰醋酸5ml甘油50ml鉀礬（硫酸鋁鉀）約5g（飽和量）蒸餾水50ml配法：ⅰ、將蘇木精溶于約15ml的純酒精中，再加冰醋酸后攪拌。

 

ⅱ、當蘇木精溶解后即將甘油倒入并搖動容器，同時加入其余的酒精。

 

ⅲ、將鉀礬在研缽中研碎并加熱，然后將它溶解于水中。

 

ⅳ、將溫熱的鉀礬溶液一滴一滴地加入上述染液中，并隨時攪動。

 

ⅴ、此液混合完畢，將瓶口用一層紗布包著小塊棉花塞起來，放在暗處通風的地方，并經常搖動以促進它的成熟。

 

成熟時間約3~4周。

 

若加入0.2g碘酸鈉，可立刻成熟。

 

此液穩定而染色均勻，染核效果良好，不會發生沉淀，長期貯備無妨。

 

此液可分別與伊紅等進行二重染色。

 

3、1%伊紅酒精溶液：伊紅1g溶于100ml95%酒精溶液。

 

4、1%鹽酸乙醇液鹽酸1份70%酒精100份5、甘油蛋白貼片劑：蛋白50ml甘油50ml水楊酸鈉（防腐劑）1g配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經數小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。

 

此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。

 

最后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。

 

可保存幾個月。

 

（三）材料鼠肝實驗程序1、取材頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或小腸）。

 

切取的組織塊不宜太大，以便固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10mm×10mm×2mm為宜。

 

取下所需要的肝組織，切成一小塊2~3mm厚。

 

取材的注意事項：（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。

 

（2）切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。

 

2、固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，固定30~50min。

 

固定的注意事項：（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。

 

（2）有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。

 

（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1~2次新液。

 

（4）材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，并隨同材料在溶液中投入相應的標簽，以免相互混淆。

 

標簽上注明固定液、材料來源、日期等。

 

標簽上的文字，應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。

 

1、洗滌材料經固定后，除乙醇外，組織中的固定液必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的固定液。

 

因為殘留在組織中的固定液，有的不利于染色，有的產生沉淀或結晶影響觀察。

 

沖洗方法根據固定液的性質而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用50%~70%乙醇沖洗。

 

2、脫水30%、50%、70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水各40min，放入95%、100%各兩面三刀次，每次20min。

 

各種材料經固定與洗滌后，組織中含有大量水分，由于水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。

 

脫水注意事項（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。

 

（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。

 

（3）在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。

 

（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。

 

（5）如需過夜，應停留在70%酒精中。

 

（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現白色混濁現象5、透明純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明為止），須換一次二甲苯。

 

由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經過二甲苯以過渡。

 

當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現出不同程度的透明狀態。

 

透明注意事項（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。

 

（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。

 

（3）在透明過程中，如果材料周圍出現白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應退回純酒精中重新脫水，然后再透明。

 

6、透蠟放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各20~30分鐘。

 

透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以便包埋。

 

透蠟時間根據組織的透蠟時間較長，約需1~2d。

 

透蠟應在恒溫箱內進行，并保持箱內溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發脆。

 

置于恒溫箱0.5h。

 

透蠟注意事項（1）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；

 

（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；

 

（3）操作要迅速，力求在最短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。

 

1、包埋將經過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器內，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊。

 

用于包埋的石蠟的熔點在50~60℃之間，包埋時應根據組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點的石蠟。

 

一般動物材料常用的石蠟熔點為52~56℃，植物材料用的石蠟熔點為54~58℃。

 

包埋的操作過程包埋時，將紙盒放在已經加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。

 

輕輕將紙盒兩側的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。

 

待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。

 

2、切片①將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。

 

②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。

 

③搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。

 

④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。

 

⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。

 

⑥一切調整好后主可以開始切片。

 

此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40~50r/min。

 

⑦切成的蠟帶到20~30cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。

 

⑧用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。

 

⑨切片工作結束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。

 

3、貼片①、取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑于玻片中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。

 

②、滴1~2滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻片上。

 

③、用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。

 

④、把玻片擺好片位置，在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展。

 

或放置置于預先加熱的展片臺上（溫度保持在40~45℃）。

 

此時蠟片因受熱而伸展攤平。

 

并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。

 

⑤、展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于37℃溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

 

10、脫蠟復水石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各3~5min，再放入蒸餾水中3min。

 

染色液多數為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。

 

一般采用二甲苯脫蠟，逐級復水與脫水浸蠟過程正好相反，但是，由于蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。

 

11、染色切片放入蘇木精中染色約10~30min。

 

染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。

 

室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。

 

12、水洗用自來水流水沖洗約15min。

 

沖洗過程中使切片顏色發藍（或放入堿性水中也可，但用促藍劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應以流水沖洗使切片顯示藍色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。

 

13、分化就是將細胞質著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。

 

將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份 70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數秒至數十秒鐘。

 

這一步驟是H.E.染色成敗的關鍵，，如分化不當會導致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。

 

如果染色適中，可取消此步驟。

 

14、漂洗切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。

 

低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結構清楚；

 

細胞質或結締組織纖維成分無色為標準。

 

然后放入蒸餾水中漂洗一次。

 

15、脫水Ⅰ切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

 

16、復染用0.5%伊紅乙醇液對比染色2~5min。

 

伊紅主要染細胞質，著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。

 

反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。

 

可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質容易著色，并且經乙醇脫水時不易褪色。

 

17、脫水Ⅱ放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3~5min。

 

最后用吸水紙吸干多余的乙醇。

 

18、透明切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約5min，然后放入純二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。

 

二甲苯應盡量保持無水，應經常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。

 

切片如在二甲苯中出現白霧現象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。

 

19、封藏：中性樹膠封存切片經染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久保存切片，便于鏡檢。

 

常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。

 

如果切片是經二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。

 

如果切片是直接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標本。

 

封藏的方法：封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。

 

材料透明后，按照下列方法進行封藏。

 

在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產生氣泡。

 

如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。

 

如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。

 

染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

 

石蠟切片法實例（二）——番紅-固綠對染法目的要求1、熟悉植物石蠟切片的制作過程。

 

2、掌握番紅-固綠對染法的基本原理和具體方法。

 

實驗原理石蠟切片法也是在研究植物細胞的形態結構等方面常用的制片方法。

 

它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成連續薄片，切片經染色，觀察效果甚好。

 

番紅-固綠對染法，為植物制片上最普遍的一種二重染色法，其染色程序簡單并能清晰地顯示出細胞的結構。

 

番紅為堿性染料，能使細胞核及木質化的細胞壁染成紅色；

 

固綠為酸性染料，能使細胞質及纖維素的細胞壁染成綠色。

 

實驗用品（一）器材切片刀，切片機，溫箱，溫臺，解剖刀，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，蠟鏟，酒精燈，包埋紙盒，染色缸，玻片盤，溫度計，臉盆。

 

（二）試劑FAA固定液，1%番紅，1%固綠，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，石蠟，郝普特氏明膠粘片劑，樹膠。

 

試劑配法：1、FAA固定液（福爾馬林-醋酸-灑精混合液）福爾馬林5ml50%或70%的灑90ml冰醋酸5ml此液適用于植物組織，此液中的酒精，有用50%的，也有用70%的，一般薄嫩的材料右用50%的，厚硬的材料用70%的，醋酸的用量也可根據材料情況作適當的改變，對一些大塊而密實的組織可增加用量，同時減少福爾馬林的用量。

 

固定時間可因材料及醋酸含量的變化而異，一般為5~20h。

 

固定的材料，一般無需用水洗，可直接從70%的酒精開始脫水。

 

1、1%番紅番紅1g溶于100ml水中。

 

2、1%固綠1g固綠溶于100ml95%酒精中。

 

3、郝普特氏明膠粘片劑明膠1g蒸餾水100ml石炭酸2g甘油15ml配制時先將明膠溶解于30℃的蒸餾水中（在水浴鍋內進行），待溶解后再加石炭酸和甘油，攪拌均勻后，趁熱過濾，貯存于玻璃瓶中。

 

（三）材料大豆、小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆等。

 

實驗程序1、取材取已培養好的大豆、小麥、蠶豆根或莖、葉等用刀片將其尖端約1.2cm根尖切割下來，用刀片切割其成熟區部分成5mm長的小段（亦可切帶側根的部分），將切好的材料放入玻管中。

 

2、固定將FAA固定液倒入盛有材料的玻管中，固定時間為24h。

 

3、沖洗用70%酒精換洗3次，每次0.5-2h。

 

4、脫水80%、90%酒精各1-2h，純酒精（中間換一次）1-2h。

 

5、透明等量純酒精及二甲苯中1-2h，二甲苯（中間換一次）1-2h。

 

6、透蠟方法同前。

 

7、包埋方法同前。

 

8、切片根為橫切面，其厚度為8~10um。

 

9、貼片。

 

方法同前。

 

10、番紅-固綠對染法染色程序如下：（1）切片在二甲苯中脫蠟，約10min。

 

（2）等量純酒精二甲苯5min。

 

（3）經純酒精，95%、90%、80%、70%、505、305各級酒精各5min。

 

（4）蒸餾水2-5min。

 

（5）1%番紅水溶液染色2h左右。

 

（6）用水洗去多余染液。

 

（7）50%、70%、80%、90%、95%各級酒精脫水10min。

 

（8）1%的固綠（用95%酒精配制）染色10-40s。

 

（9）95%酒精洗一下。

 

（10）純酒精脫水5min。

 

（11）等量純酒精二甲苯混合液中5min。

 

（12）二甲苯5min。

 

（13）中性樹膠封藏。

 

注意：（1）番紅與固綠在酒精中很容易脫色，因此在酒精中脫水時，不能放置太久。

 

（2）用固綠對染之前應檢查番紅染色的是否合適，所染顏色應稍深一些，以防其在以后脫水步驟中仍會脫色，如果太淺，應退回重染。

 

引用：http://big5.wiki8.com/shilaqiepian_48487/