【醫學百科●總RNA提取】

楊籍富

【醫學百科●總RNA提取】

 

拼音

 

zǒngRNAtíqǔTrizolReagent

處理法

 

原理分離純凈、完整的RNA分子對于分子克隆的實驗是很重要的，而且是進行基因表達分析的基礎。

 

在總RNA中，75-85%為rRNA（主要是28S-26S/23S和18S/16SrRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等組成。

 

為了獲得高質量的RNA，必須要控制RNA酶的活性，也就是要避免RNA酶的污染。

 

RNA酶很穩定，而且反應不需要輔助因子，因而在RNA的制備過程中只要存在少量的RNA酶就會導致實驗的失敗。

 

為避免RNA酶的污染，實驗中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需要特別處理。

 

RNA酶的抑制劑主要有異硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯（DEPC，使用濃度為0.05%-0.1%）、釩氧核糖核苷復合物（10mmol/L）、蛋白質抑制劑RNasin。

 

實驗中采用DEPC對所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等進行處理。

 

儀器與試劑儀器燒杯（1000，500，100，50mL若干）；

 

量筒（1000，500，250，50，20mL若干）；

 

玻璃棒、藥勺、試劑瓶、三角瓶、吸頭（1000，200，20微升）、吸頭盒、離心管（1.5mL，0.2mL）、冷凍高速離心機、紫外分光光度計等。

 

試劑滅菌的DEPC水、氯仿：異戊醇（24：1）、異丙醇、75%乙醇、TrizolReagent、

 

實驗步驟準備工作：用DEPC（1ml/L）水溶液處理槍頭、離心管等24hr，然后高溫滅菌2次，每次20min；

 

研缽、剪刀等其他用具在180℃下烘3hr。

 

1、組織勻漿，在液氮中將組織研碎后，加入500μlTrizol后再充分研磨，用槍頭將粉末轉移到離心管中，加入500μlTrizol后用注射器抽打均勻，室溫下放置5min；

 

2、加200μl氯仿，劇烈振蕩15sec，顛倒幾次，室溫下放置15min；

 

3、4℃下12,000rpm離心15min；

 

4、轉移上清液至一新的離心管（DEPC處理）中，加500μl異丙醇，振蕩混勻，室溫下放置5～10min；

 

5、4℃下12,000rpm離心8min；

 

6、棄上清液，加1ml75%乙醇，漩渦混勻（或加無水乙醇以加快揮發）；

 

7、4℃下7,500rpm離心5min；

 

8、棄乙醇，空氣風干3～5min，用DEPC處理過的水（先在55～60℃水浴10～15min）溶解,根據沉淀的量，一般加入30～50μl；

 

9、RNA質量的檢測，取1μlRNA樣品稀釋100倍后測定RNA濃度及OD260/280；

 

10、RNA保存于-80℃冰箱。

 

引用：http://big5.wiki8.com/zongRNAtiqu_48489/