【醫學百科●藥敏試驗】

楊籍富

【醫學百科●藥敏試驗】

 

概述

 

藥物敏感試驗簡稱藥敏試驗（或耐藥試驗）。

 

旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導臨床合理選用抗生素藥物的微生物學試驗。

 

一種抗生素如果以很小的劑量便可抑制、殺滅致病菌，則稱該種致病菌對該抗生素“敏感”。

 

反之，則稱為“不敏感”或“耐藥”。

 

為了解致病菌對哪種抗菌素敏感，以合理用藥，減少盲目性，往往應進行藥敏試驗。

 

其大致方法是：從病人的感染部位采取含致病菌的標本，接種在適當的培養基上，于一定條件下培養；

 

同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養基表面（或用不銹鋼圈，內放定量抗生素溶液），培養一定時間后觀察結果。

 

由于致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”，稱為抑菌圈。

 

抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關系。

 

于是可以根據試驗結果有針對性地選用抗生素。

 

近年已有自動化的藥敏試驗儀器問世，使試驗更加迅速、準確。

 

目前濫用抗生素，致使抗藥菌增加，甚至因長期大量使用廣譜抗生素，殺傷體內正常微生物，失去微生物的相互制約作用，從而使一些少見的或一般情況下的非致病菌大量繁殖，引起所謂“二次感染”的情況屢有發生，給治療造成人為的困難。

 

因此，提倡使用藥敏試驗，堅持合理用藥十分重要。

 

藥敏試驗分類紙片擴散法該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。

 

同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的菌株不能生長，二抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負相關。

 

稀釋法稀釋法藥敏試驗可用于定量測試抗菌藥物對某一細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。

 

實驗時，抗菌藥物的濃度通常經過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌藥物的測試濃度范圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時也應該包含質控參考菌株的MIC.瓊脂稀釋法首先制備含抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。

 

再接種待測菌株，然后是結果判讀。

 

肉湯稀釋法抗生素濃度梯度法自動化儀器法

 

實驗步驟實驗材料普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。

 

做沙門氏菌可選擇血清培養基。

 

藥敏試紙購買或自制（詳見實驗準備）細菌待做藥敏試驗的細菌儀器接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭實驗準備藥敏片的準備：購買或自制制備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。

 

取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。

 

經15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全干燥。

 

抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內加入藥液0.25毫升，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。

 

同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。

 

切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。

 

藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；

 

如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。

 

此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。

 

實驗操作方法藥敏片法在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。

 

具體方式；

 

用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。

 

然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。

 

（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。

 

要求涂布均勻致密）將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養基表面。

 

為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。

 

為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規律的分布于平皿培養基上；

 

一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。

 

將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。

 

牛津杯法在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。

 

具體方式；

 

用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。

 

然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。

 

（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。

 

要求涂布均勻致密。

 

）以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，并在小管處標記各種藥物名稱。

 

每個平板可放4-6支小管。

 

待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液，勿使其外溢。

 

置37℃培養8-18小時，觀察結果。

 

將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。

 

打孔法該法較簡單，成本低，易操作，比較適用于商品藥物的檢測。

 

在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。

 

具體方式；

 

用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。

 

然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。

 

（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。

 

要求涂布均勻致密。

 

）以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。

 

加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。

 

將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。

 

結果觀察在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。

 

過夜培養后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。

 

其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。

 

判定標準藥敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

 

表1藥物敏感實驗判定標準抑菌圈直徑（毫米）敏感度20以上極敏15~20高敏10~14中敏10以下低敏0不敏藥物敏感實驗判定標準參考表1，多黏菌素抑菌圈；

 

在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。

 

影響藥敏結果的因素培養基應根據試驗菌的營養需要進行配制。

 

傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。

 

培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。

 

細菌接種量細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

 

藥物濃度藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。

 

商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。

 

培養時間一般培養溫度和時間為37℃8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2~4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。

 

藥敏試驗的應用

 

藥物敏感實驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協助使用，以減少耐藥菌株。

 

在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。

 

引用：http://big5.wiki8.com/yaominshiyan_107724/