【醫學百科●生物制品化學規定規程】

楊籍富

【醫學百科●生物制品化學規定規程】

 

拼音

 

shēngwùzhìpǐnhuàxuéguīdìngguīchéng

本規程載入的化學檢定項目，如采用其他方法測定，其結果與本規程所列應無顯著差異。

 

如遇制品質量存在疑問時，其最后判定應以本規程所列方法測定結果為準。

 

標準液的配制與標定方法參看新版《中國藥典》。

 

PH值測定（電位法）1儀器校準（定位）用標準緩沖溶液應使用分析純標準緩沖物質配制。

 

1.10.05mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液稱取于115±5℃干燥2～3小時的鄰苯二甲酸氫鉀（KHC8H4O4）10.12±0.01g，溶于蒸餾水，并稀釋至1000ml。

 

1.20.025mol/L磷酸氫二鈉和0.025mol/L磷酸二氫鉀混合溶液分別稱取在115±5℃干燥2～3小時的磷酸氫二鈉（Na2HPO4）3.53±0.01g和磷酸二氫鉀（KH2PO4）3.39±0.01g，溶于預先煮沸過15～30分鐘并迅速冷卻的蒸餾水中，并稀釋至1000ml。

 

1.30.01mol/L硼砂溶液稱取硼砂（Na2B4O7·10H2O）3.80±0.01g（注意：不能烘！），溶于預先煮沸過15～30分鐘并迅速冷卻的蒸餾水中，并稀釋至1000ml。

 

置聚乙烯塑料瓶中密閉保存。

 

標準緩沖溶液于0～50℃的標準pH值溫度(℃)0.05mol/L鄰苯二甲酸氫鉀0.025mol/L混合磷酸鹽0.01mol/L硼砂04.016.989.4654.006.959.39104.006.929.33154.006.909.28204.006.889.23254.006.869.18304.016.859.14354.026.849.10404.036.849.07454.046.839.04504.066.839.022操作使用玻璃電極酸度計測定，操作方法按儀器說明書進行。

 

用兩種標準緩沖溶液校正或核對，相差不得超過0.05。

 

固體總量測定甲、105℃干烤法1操作精確量取一定體積樣品于干燥至恒重的扁稱量瓶中，置105℃烤箱中烘至恒重。

 

2計算烘干后樣品重量樣品固體總量%（g/ml）=──────────×100樣品ml數乙、50℃干烤法1操作精確量取1mlA群腦膜炎球菌多糖菌苗半成品原液于已干燥至恒重的稱量瓶（2×2.5cm）中，置50℃干燥箱中，干燥至恒重。

 

2計算同105℃干烤法。

 

半微量定氮法1試劑1.1硫酸化學純，比重1.84。

 

1.2消化劑硫酸銅（CuSO4·5H2O）1份與硫酸鉀（K2SO4）10份共同研細混勻即成。

 

1.312.5mol/L氫氧化鈉液取氫氧化鈉500g，加蒸餾水至1000ml，搖勻。

 

1.42%硼酸吸收液硼酸20g加蒸餾水使溶解成1000ml，加混合指標劑10ml，搖勻。

 

1.5混合指示劑0.2%（g/ml）溴甲酚綠酒精溶液5份與0.1%（g/ml）甲基紅酒精溶液2份混合配成。

 

1.6標準0.01mol/L鹽酸或0.005mol/L硫酸溶液。

 

2操作2.1消化準確量取一定體積樣品（含氮量在1～2mg左右）于凱氏定氮瓶中，加消化劑約0.3g，濃硫酸1.0ml進行消化，至澄明藍綠色，繼續消化約60分鐘，同時做空白。

 

2.2蒸餾與滴定取10ml硼酸吸收液于100ml三角瓶內，將凱氏蒸餾器冷凝管末端浸入硼酸吸收液內，將消化好的樣品移入凱氏蒸餾器內，用蒸餾水洗定氮瓶3～4次，洗液亦移入蒸餾器內，再加5ml12.5mol/L氫氧化鈉溶液，然后進行蒸餾，待接收液總體積約35～50ml,將冷凝管末端取出液面，讓蒸汽沖洗約1分鐘，再用少量蒸餾水沖洗冷凝管末端，接收液用標準0.01mol/L鹽酸或0.005mol/L硫酸進行滴定，至溶液顯著變色。

 

3計算（樣品滴定數–空白滴定數）×標準鹽酸mol/L×14樣品總氮含量(mg/ml)=────────────────────────樣品ml數附注1.蒸餾前應蒸洗蒸餾器15分鐘。

 

2.蒸汽發生瓶內應加數滴硫酸及甲基紅指示劑至呈明顯紅色。

 

蛋白質含量測定甲、鎢酸沉淀法1試劑1.110%鎢酸鈉溶液取鎢酸鈉10g，加蒸餾水使溶解成100ml。

 

1.20.33mol/L硫酸溶液量取化學純硫酸1.86ml，緩緩注入適量的蒸餾水中，待冷加水稀釋至100ml。

 

1.30.145mol/L氯化鈉溶液取氯化鈉9g，加蒸餾水使溶解成1000ml。

 

2操作2.1鎢酸除蛋白質精確量取樣品2ml加蒸餾水14ml，加10%鎢酸鈉2ml，0.33mol/L硫酸2ml，搖勻，靜置30分鐘過濾。

 

2.2精確量取樣品1ml，用0.145mol/L氯化鈉溶液準確稀釋至每ml含氮量1mg左右。

 

2.3精確量取稀釋液1ml及除蛋白質濾液5ml，分別移入凱氏定氮瓶中，用半微量定氮法測定樣品的總氮及非蛋白氮含量。

 

3計算樣品總氮含量(mg/ml)=（樣品滴定數-空白滴定數）×標準鹽酸mol/L×14×稀釋倍數樣品非蛋白氮含量(mg/ml)=（樣品滴定數-空白滴定數）×標準鹽酸mol/L×14×12樣品蛋白質含量(g/ml)=（總氮-非蛋白氮）×6.25×1/10附注1.樣品蛋白質含量如超過10%(g/ml)，除蛋白質時應適當加大樣品稀釋倍數，10%鎢酸鈉及0.33mol/L硫酸用量相應地按比例增加，使溶液鎢酸濃度仍保持1%。

 

2.總氮與非蛋白氮可用同一空白。

 

乙、三氯醋酸沉淀法12%三氯醋酸溶液取三氯醋酸12g，加蒸餾水溶解至100ml。

 

2操作精確量取一定體積的樣品（含蛋白質6～12mg左右，于10ml尖底離心管中，加等體積的12%三氯醋酸混勻，放置半小時后3000r/min離心30分鐘，傾凈上清，沉淀用蒸餾水約3ml（分數次）洗入凱氏燒瓶，按半數量定氮法測定氮含量。

 

3計算（樣品滴定數–空白滴定數）×標準鹽酸mol/L×14樣品蛋白質含量(mg/ml)=─────────────────────×6.25樣品ml數丙、微量法（Lowry法）1.試劑1.14%碳酸鈉溶液取4g碳酸鈉，加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.20.2mol/L氫氧化鈉溶液取0.8g氫氧化鈉加蒸餾水，溶解成100ml。

 

1.30.04mol/L硫酸銅溶液取1gCuSO4·5H2O加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.42%酒石酸鉀（或0.1mol/L酒石酸鈉）取2g酒石酸鉀（或酒石酸鈉），加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.5堿性銅液臨用前取試劑1.1和1.2各25ml，試劑1.3和1.3各0.5ml混勻配制而成。

 

1.6酚試劑稱取100g鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O),25g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)，置1500ml燒瓶中，加入700ml蒸餾水，50ml85%磷酸及100ml濃鹽酸，上聯回流管（使用木塞或錫紙包裹的橡皮塞）微沸加流10小時，取下回流管，加入150g硫酸鋰，50ml蒸餾水，幾滴溴液，煮沸約15分鐘，驅除過量的溴。

 

冷卻，加蒸餾水稀釋至1000ml，過濾，為酚試劑貯備液。

 

酚試劑貯備液經標準氫氧化鈉液滴定，測定酸濃度，而后用蒸餾水稀釋至相當1mol/L鹽酸濃度，即為酚試劑。

 

1.7標準蛋白質溶液取牛血清白蛋白標準品（由檢定所統一標定發給），準確稀釋至1mg/ml(含0.02%NaN3)，為標準蛋白質貯備液。

 

精確量取標準蛋白質貯備液2.5ml于25ml容量瓶中，用含0.02%NaN3的蒸餾水稀釋至刻度，為標準蛋白質溶液（100μg/ml）。

 

2操作2.1樣品精確量取一定體積樣品（含蛋白質50μg左右）于試管中，加5ml堿性銅液，混勻，于室溫放置10分鐘，快速加入0.5ml酚試劑，搖勻，于室溫放置30分鐘，用650nm波長或紅色濾光片比色（呈色后，如發現混濁，經3000r/min離心15分鐘后再比色）。

 

2.2標準曲線精確量取標準蛋白質溶液（100μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置于試管中，加蒸餾水補至1ml，其余操作同樣品，可得一標準曲線。

 

3計算從標準曲線查出樣品相當標準蛋白質溶液之ml數A；

 

A×0.01%樣品蛋白質含量（g/ml）=────────樣品ml數附注檢測A群腦膜炎多糖抗原半成品原液可取1ml（含抗原3～10mg）。

 

硫酸銨含量測定1試劑1.11mol/L氫氧化鈉液取化學純氫氧化鈉20g，加蒸餾水溶解成500ml。

 

2操作2.1除蛋白質方法同蛋白質含量測定。

 

2.2蒸餾精確量取除蛋白質濾液10ml于凱氏蒸餾器內，加1mol/L氫氧化鈉1ml，加少量蒸餾水，按半微量定氮法進行蒸餾、滴定。

 

3計算樣品硫酸銨含量%（g/ml）=（樣品滴定數-空白滴定數）×標準鹽酸mol/L×14×4.715×1/10

 

氯化鈉含量測定1試劑1.10.1mol/L硝酸銀溶液取硝酸銀17g，加蒸餾水溶解成1000ml。

 

1.2標準0.05mol/L硫氰酸銨溶液1.35.5mol/L硝酸1.48%硫酸鐵銨指示液取8g硫酸鐵銨，加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.5飽和高錳酸鉀取高錳酸鉀6.5g，加蒸餾水溶解成100ml。

 

2操作2.1精確吸取樣品1ml，準確加入0.1mol/L硝酸銀溶液5ml，混勻（蛋白質含量高者加2ml飽和高錳酸鉀），加10ml硝酸(5.5mol/L)，直接加熱消化至溶液澄清為止。

 

待冷，加蒸餾水50ml,8%硫酸鐵銨指示液1ml,用標準0.05mol/L硫氰酸銨溶液滴定至溶液呈淡棕紅色，振搖勻仍不退色，即為終點。

 

2.2空白試驗準確量陬0.1mol/L硝酸銀溶液5ml，加硝酸(5.5mol/L)10ml，可不消化，其余操作同樣品。

 

3計算樣品氯化鈉含量%(g/ml)＝（空白滴定數－樣品滴定數）×硫氰酸銨mol/L×5.845

 

鈉離子含量測定（火焰亮度法）1試劑標準鈉溶液：精確稱取于110℃干燥至恒重的NaCl2.9227g,用雙蒸水溶解并稀釋至1000ml,為500mmol/L標準鈉溶液。

 

2操作2.1樣品精確量取樣品0.5ml于50ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，于火焰亮度計，589nm波長（或黃色濾光片）測其透光度。

 

2.2標準曲線精確量取標準鈉溶液0.9、1.1、1.3、1.5、1.7ml于50ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，鈉含量分別為0.9、1.1、1.3、1.5、1.7mmol/L，其余操作同樣品。

 

3計算由標準曲線上查出稀釋后樣品鈉含量為ammol/L。

 

樣品鈉含量(mmol/L)=A×100

 

鉀離子含量測定（火焰亮度法）1試劑標準鉀溶液：精確稱取于110℃干燥至恒重的KCl0.3728g，用雙蒸水溶解并稀釋至500ml，為10mmol/L標準鉀溶液。

 

2操作2.1樣品精確量取樣品2ml于50ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，于火焰亮度計769nm波長（或紅色濾光片）測其透光度。

 

2.2標準曲線精確量取標準鉀溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75ml于50ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，鉀含量分別為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15mmol/L，其余操作同樣品。

 

3計算由標準曲線上查出稀釋后樣品鉀含量為Ammol/L。

 

樣品鉀含量(mmol/L)=A×25

 

枸櫞酸離子含量測定1試劑1.1標準枸櫞酸鈉濃溶液精確稱取枸櫞酸鈉(Na3C6H標準5O7·2H2O)0.5882g,加蒸餾水溶解，并準確稀釋至100ml，為20mmol/L枸櫞酸鈉液。

 

1.2標準枸櫞酸鈉溶液精密量取標準枸櫞酸鈉濃溶液5ml，用5%三氯醋酸準確稀釋至50ml，為2mmol/L枸櫞酸鈉標準液。

 

1.310%三氯醋酸：稱取三氯醋酸10g，用蒸餾水稀釋至100ml。

 

1.45%三氯醋酸：稱取三氯醋酸5g，用蒸餾水稀釋至100ml。

 

1.5砒啶(A·R)。

 

1.6醋酸酐(A·R)。

 

2操作2.1樣品精確量取0.5ml樣品，加4.5ml蒸餾水，加5ml10%三氯醋酸，混勻，置60℃水浴5分鐘，離心去沉淀。

 

精確量取1ml上清液于25ml玻塞試管中，加1.3ml吡啶，混勻，加5.7ml醋酸酐，立即混勻并置于31℃水浴，準確培育35分鐘后，于425nm波長下測OD值，同時做空白試驗：取1ml5%三氯醋酸代替1ml去蛋白后樣品上清液，其余操作同樣品。

 

2.2標準曲線精確量取標準枸櫞酸鈉溶液0.0、0.25、0.50、0.75、1.0ml,分別加5%三氯醋酸1.0、0.75、0.5、0.25、0.0ml（其相應的枸櫞酸鈉離子含量為0、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/l），其余操作從加1.3ml吡啶開始同樣品。

 

可得一標準曲線。

 

3計算由標準曲線查得樣品稀釋液相當標準枸櫞酸離子Ammol/L。

 

樣品枸櫞酸離子含量(mmol/L)=A×20

 

亞硫酸氫鈉含量測定1試劑1.10.1mmol/L碘液1.2標準0.1mmol/L硫代硫酸鈉液1.30.5%淀粉指示劑取可溶性淀粉0.5g，加蒸餾水5ml攪勻后，緩緩傾入100ml沸蒸餾水中，隨加隨攪拌，煮沸，至適成稀薄的半透明液，放置使沉淀，傾取上層清液（配制時可加適當的防腐劑）。

 

1.46mol/L鹽酸2操作精確量取腦炎疫苗5~10ml或一定體積亞硫酸氫鈉液（含亞硫酸氫鈉2.5mg左右）于碘瓶中，精確加入0.1mol/L碘液20ml，放置5分鐘，沿瓶壁加6mol/L鹽酸2ml，搖勻，用標準0.1mol/L硫代硫酸鈉液滴定至溶液呈淺黃色，加0.5%淀粉指示劑約0.5ml，滴定至藍色消失，同時做空白。

 

(空白滴定數-樣品滴定數)×硫代硫酸鈉mol/L×5.203樣品亞硫酸氫鈉含量%（g/ml）=─────────────────────樣品ml數附注如測定樣品為亞硫酸氫鈉液，只需根據其濃度和取樣量，在測定時適當增加0.1mol/L碘液的用量即可。

 

氫氧化鋁（或磷酸鋁）含量測定甲、滴定法1試劑1.10.05mol/LEDTA標準液。

 

1.2標準0.025mol/L鋅液。

 

取標準0.05mol/L鋅液稀釋。

 

1.3Ph4.5醋酸銨緩沖液稱取醋酸銨77.1g，溶于適量的蒸餾水中，加冰醋酸58ml,稀釋至1000ml。

 

1.40.1%二甲酚橙指示劑。

 

1.50.95mol/L磷酸量取磷酸6ml，稀釋至100ml。

 

2操作精確量取吸附精制類毒素適量（含鋁1～10mg），置250ml三角瓶中，加0.95mol/L磷酸1.5ml，使完全溶解。

 

必要時于水浴加溫（難于溶解時尚可適當增加磷酸量）。

 

加0.05mol/LEDTA10ml,Ph4.5醋酸銨緩沖液10ml，于沸水浴中加熱10分鐘，冷至室溫加0.1%二甲酚橙1ml，用0.025mol/L鋅標準液進行滴定，當溶液由亮黃轉變為橙色，即為終點。

 

同時做空白試驗。

 

3計算(空白滴定數-樣品滴定數)×標準鋅液mol/L×78.01樣品氫氧化鋁含量(mg/ml)=───────────────────────樣品ml數(空白滴定數-樣品滴定數)×標準鋅液mol/L×121.95樣品磷酸鋁含量(mg/ml)=────────────────────────樣品ml數(空白滴定數-樣品滴定數)×標準鋅液mol/L×26.98樣品鋁含量(mg/ml)=────────────────────────樣品ml數乙、比色法1試劑1.10.95mol/L磷酸取磷酸6ml，稀釋至100ml。

 

1.21.5mol/L鹽酸1.31.2mol/L鹽酸1.40.2%鋁試劑溶液1.51.3mol/L醋酸銨溶液1.6標準鋁溶液精確稱取鉀明礬[KAl(SO4)2·12H2O]0.3518g,加1.5mol/LHCl8ml，加蒸餾水到1000ml，為含鋁20μg/ml的標準液。

 

2操作2.1樣品精密量取吸附制品1ml(含鋁0.5～1mg)于50ml容量瓶中，加0.95mol/L磷酸1.5ml,使完全溶解（必要時于水浴加溫），用水稀釋至刻度。

 

取稀釋樣品1ml于25ml帶塞刻度試管中，加1.2mol/L鹽酸1ml,加水15ml,0.2%鋁試劑1ml，搖勻，加1.3mol/L醋酸銨溶液5ml,加水至25ml,搖勻，放置15分鐘，用530nm波長比色。

 

2.2標準曲線取標準鋁溶液0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25ml于25ml帶塞刻度試管中，鋁含量分別為0、5、10、15、20、25μg，其余操作同樣品管。

 

繪制標準曲線。

 

3計算由標準曲線查出鋁含量為Aμg。

 

Al(OH)3(mg/ml)=A×2.8918×50/1000Al(PO4)(mg/ml)=A×4.52×50/1000附注邊緣制品以滴定法為準。

 

游離甲醛測定1試劑1.1復紅亞硫酸試劑1.1.1取堿性復紅4.5g于3000ml三角瓶中加蒸餾水1500ml,振搖或加溫使復紅全部溶解，待冷后，加10g亞硫酸鈉，搖勻，靜置5～10分鐘，再加入40ml3mol/L硫酸，搖勻，以橡皮塞塞緊瓶口，放置過夜，如有顏色，加骨炭5～10g迅速搖勻，以布氏漏斗快速抽濾。

 

1.1.2試劑之SO2含量可控制在28～48mmol/L(SO2含量過多可通空氣驅除之，過少可通入SO2)。

 

SO2含量測定：吸取復紅亞硫酸試劑10ml于三角瓶內。

 

加蒸餾水20ml，0.5%淀粉指示劑5ml，用0.1mol/L碘液滴定至呈淺藍色。

 

計算：SO2mmol/L=50×碘液ml數×碘液mmol/L1.2混合酸量取蒸餾水783ml于燒杯內，緩緩注入42ml鹽酸，175ml硫酸，混勻。

 

1.3標準甲醛溶液為0.005%(g/ml)甲醛溶液。

 

精確量取已標定的甲醛溶液Vml，于500ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，臨用時10倍稀釋。

 

500×0.05V=─────────────標定甲醛溶液含量%（g/ml）2操作2.1樣品精確量取樣品1ml，用蒸餾水稀釋至甲醛含量在0.003%(g/ml)左右。

 

取稀釋液2ml于50ml比色管中加蒸餾水到5ml，加10ml復紅試劑，10ml混合酸，搖勻，在25℃放置3小時，用590nm波長比色。

 

2.2標準曲線精確量取0.005%(g/ml)標準甲醛溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0ml，分別置于50ml比色管中，加蒸餾水至總體積為5ml，其余操作同樣品。

 

可得一標準曲線。

 

3計算從標準曲線查出樣品相當標準甲醛溶液之ml數A。

 

樣品游離甲醛含量%（g/ml）=A×0.005×稀釋倍數附注1.標準液和樣品與復紅試劑的顯色時間，有時不一致，測定時，顯色慢者應酌情早加復紅試劑。

 

2.樣品中如含有酚紅，標準管中應予以校正。

 

3.可做限度測定。

 

苯酚含量測定1試劑1.10.02mol/L溴液取0.56g溴酸鉀，加3g溴化鉀，加蒸餾水溶解成1000ml。

 

1.225%碘化鉀溶液取碘化鉀25g，加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.3標準0.02mol/L硫代硫酸鈉溶液取標準0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液準確稀釋5倍。

 

1.46mol/L鹽酸溶液1.5淀粉指示劑取可溶性淀粉0.5g，加蒸餾水5ml，攪勻后，緩緩傾入100ml的沸水中，隨加隨攪拌，煮沸，至適成稀薄的半透明液，放置，俟沉淀，傾取上層清液（配制時可加適當的防腐劑）。

 

1.60.17mol/L硫酸鋅溶液取硫酸鋅5g加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.7飽和氫氧化鋇溶液取氫氧化鋇[Ba(OH)2·8H2O]5.6g，加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.80.5%酚酞指示劑取酚酞0.5g，加乙醇100ml,使溶解即得。

 

2操作2.1菌苗類樣品精確量取樣品1ml于碘瓶中，加入蒸餾水約50ml，精確加入0.02mol/L溴液15～25ml（樣品含苯酚量0.3%～0.5%加25ml，小于0.3%則加15ml），沿瓶壁加入鹽酸（6mol/L）10ml，搖勻，密塞，在暗處置30分鐘后，加25%碘化鉀2ml于碘瓶頸口，稍啟瓶塞，使流下，密塞，搖勻。

 

以少量蒸餾水洗瓶頸，用標準0.02mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至溶液呈淺黃色，加淀粉指示劑約0.5ml，滴定至藍色消失。

 

同時做空白試驗。

 

2.2人胎盤血丙種球蛋白及疫苗類樣品精密量取除蛋白（方法同蛋白含量測定鎢酸除蛋白法）后濾液5ml于碘瓶中，其余操作同2.1項。

 

2.3人胎盤組織液精確量取樣品5ml于50ml容量瓶內，加適量蒸餾水，加0.5%酚酞指示劑2滴，加5%硫酸鋅溶液2ml，飽和氫氧化鋇溶液約2.5ml（加至溶液呈粉紅色），加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘，過濾。

 

精確量取濾液5ml于碘瓶中，其余操作同2.1項。

 

3計算3.1菌苗類樣品苯酚含量%（g/ml）=（空白滴定數-樣品滴定數）×硫代硫酸鈉mol/L×1.5693.2人胎盤血丙種球蛋白（或人胎盤組織液）及疫苗類樣品苯酚含量%（g/ml）=（空白滴定數-樣品滴定數）×硫代硫酸鈉mol/L×1.569×2附注1.蛋白類制品由于除蛋白后濾液仍含有小分子物質，對苯酚含量測定有干擾，使結果偏高，邊緣制品可用蒸餾法，取除蛋白濾液5ml于凱氏蒸餾器內，接受液為0.02mol/L溴液15～25ml，蒸餾約20分鐘后其余操作同上。

 

2.可做限度測定。

 

硫柳汞及硝酸汞苯含量測定1試劑1.10.05%雙硫腙濃溶液稱取純凈雙硫腙50mg，溶于100ml氯仿中，保存于冷暗處。

 

1.20.00125%雙硫腙滴定液臨用時取0.05%雙硫腙濃溶液2.5ml，用四氯化碳稀釋至100ml。

 

1.3濃硫酸1.48.0mol/L硝酸溶液1.520%鹽酸羥胺溶液1.6標準汞濃溶液精確稱取于H2SO4干燥器干至恒重的氯化高汞（HgCl2分析純）0.1354g，用0.5mol/LH2SO4溶解并準確稀釋至100ml，為1mg汞/ml溶液。

 

1.7標準汞溶液（50μg汞/ml）精確量取標準汞濃溶液5ml，用0.5mol/LH2SO4準確稀釋至100ml。

 

2操作2.1消化精確量取樣品（含汞約50μg）于150ml圓底磨口燒瓶（附長40cm回流管）中，加濃硫酸2ml，5.5mol/L硝酸0.5ml，電爐上加熱回流15分鐘（或于3×24cm試管中，加蓋，于85～90℃水浴加熱1小時），冷卻后加蒸餾水40ml，加20%鹽酸羥胺5ml。

 

2.2滴定將上述樣品用40ml水分數次沖洗入125ml分液漏斗中，用0.00125%雙硫腙滴定液滴定，開始時每次可加入2ml左右，以后逐漸減少，至每次0.5ml，最后還可少至0.2ml。

 

每次加入滴定液后，振搖10秒鐘，靜置分層，棄去四氯化碳層，繼續滴定，直至雙硫腙液的綠色不變，即為終點。

 

抗毒素及丙種球蛋白樣品用水浴消化法滴定時會出現少量絮狀物，但不影響結果。

 

2.3雙硫腙滴定液的標化精確量取標準汞溶液1ml于125ml分液漏斗中，加濃硫酸2ml，加蒸餾水80ml，20%鹽酸羥胺5ml，用雙硫腙滴定液滴定，操作同上。

 

3計算0.050×2.04100硫柳汞含量%（g/ml）=樣品滴定數×────────×────────標準汞液滴定數樣品ml數×10000.050×1.58100硫酸汞苯含量%（g/ml）=樣品滴定數×────────×────────標準汞液滴定數樣品ml數×1000附注可做限度測定

 

氯仿含量測定1試劑1.1乙醚不應含過氧化物，否則應加硫酸亞鐵蒸餾。

 

1.220%氫氧化鈉溶液取氫氧化鈉100g，加蒸餾水至500ml。

 

1.3堿性吡啶20%氫氧化鈉溶液2份，加吡淀5份，振搖至呈鹼性，放置分層，取上層液（此液需臨時配制，如顯紅色，吡啶需重蒸餾）。

 

1.495%乙醇1.5標準氯仿液精密量取氯仿1ml于100ml容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，為1%氯仿溶液。

 

臨用前用蒸餾水準確稀釋10倍，為0.1%(ml/ml)氯仿標準液。

 

2操作2.1樣品精確量取樣品1ml加蒸餾水4ml。

 

精確量取樣品稀釋液0.5ml于玻塞試管中，加乙醚18ml，猛烈振搖3分鐘，靜置。

 

于刻度玻塞試管中加5ml堿性吡啶。

 

加5ml乙醚提取液，混勻，置80℃水浴中加熱8分鐘，取出后用水冷卻，加蒸餾水至12ml，充分振搖，靜置分層，傾去上層液，用綠色濾光片比色。

 

2.2標準曲線精確量取0.1%氯仿標準液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，各管加蒸餾水至0.5ml，其余操作同樣品，可得一標準曲線。

 

3計算由標準曲線查得樣品稀釋液相當標準氯仿液之ml數A。

 

樣品氯仿含量=A%（ml/ml）附注1.配制堿性吡啶的氫氧化鈉須不含碳酸鈉，否則有混濁現象。

 

2.可做限度測定

 

費休（K.Fischer）氏水分測定法1試劑1.1無水吡啶取吡啶200ml，置干燥的蒸餾瓶中，加苯40ml，加熱蒸餾，收集114～116℃蒸餾出的吡啶，含水量應在0.1%以下。

 

1.2無水甲醇取甲醇1000ml，于干燥蒸餾瓶中，加金屬鎂約15g與二氯化汞0.4g（或碘0.5g）回流2～4小時，然后蒸餾（蒸餾儀器均需干燥），收集64～65℃蒸餾出的甲醇，含水量應在0.05%以下。

 

1.3二氧化硫工業用，如無二氧化硫可用硫酸及亞硫酸鈉配制。

 

Na2SO3 H2SO4→Na2SO4 H2SO3H2SO3→H2O SO2按此反應根據SO2之需要量計算亞硫酸鈉及硫酸之用量，將亞硫酸鈉置于瓶中，加少量水，緩緩加入硫酸，將生成之二氧化硫通過濃硫酸洗氣瓶，再通入費休氏試劑瓶中。

 

1.4費休氏試劑取干燥的1000ml玻璃容器，加入碘42.33g與無水吡啶133.3ml，加塞，振搖至碘全部溶解后，加無水甲醇333.3ml，稱定重量，將此瓶置冰浴中，用密閉裝置導入經濃硫酸洗氣瓶脫水的二氧化硫直至重量增加32g為止，密封避光保存。

 

1.5標準水的制備與標化1.5.1制備于干燥無水的50ml容量瓶中，精密稱取0.4g左右雙蒸水，用無水甲醇稀釋至刻度，密封保存。

 

1.5.2標化精密量取標準水1ml與制備標準水用的無水甲醇5ml分別置于干燥帶塞的玻瓶中，用費休氏試劑滴定至溶液呈棕黃色。

 

1.5.3計算稱取水重為Amg。

 

1ml標準水所需費休氏試劑為Bml。

 

5ml無水甲醇所需費休氏試劑為Cml。

 

每ml費休氏試劑相當于水的mg數為N=A/50/B-C/51ml標準水之含水量（mg）=N×B2操作2.1精密稱取干燥制品0.1～0.5g于干燥帶塞的玻瓶中，加無水甲醇5ml（按取樣量情況可酌情減少甲醇加量），不斷振搖，用費休氏試劑滴定至棕黃色，經振搖1分鐘不退色，即為終點。

 

同時取無水甲醇5ml作空白試驗。

 

2.2費休氏試劑標化精密量取標準水1ml于干燥帶塞的玻瓶中，用費休氏試劑滴定至終點。

 

1ml標準水含水量（mg）費休氏試劑效價N=────────────費休氏試劑滴定數3計算（樣品滴定數-空白滴定數）×N1樣品水分含量%（g/g）=────────────────×──樣品重量10附注1．配制試劑及測定樣品用的全部儀器均應干燥至無水。

 

2．布氏菌病活菌苗及鼠疫活菌苗等制品能在費休氏試劑中溶解，可不用加無水甲醇提取。

 

3．空氣中濕度大，對水分測定有影響，取樣時應備有防濕裝置。

 

相對濕度應30%以下。

 

4．有條件可采用卡氏水分測定儀測定。

 

5．如樣品中含有干擾物質，可采用五氧化二磷真空低溫干燥法測定。

 

5.1試劑五氧化二磷（工業用）。

 

5.2操作取制品0.2～1.0g置于已干燥至恒重的稱量瓶中，加蓋，精確稱定重量（稱量瓶中樣品厚度應在5mm以下），放入五氧化二磷干燥器中，打開瓶蓋，于60℃將干燥器抽真空至133Pa以下，干燥至恒重。

 

干燥完畢應緩慢通入經濃硫酸脫水的干燥空氣。

 

5．3計算樣品水分含量%（g/g）=干燥失重/樣品重量×100

 

人白蛋白吸收度測定1儀器1．1分光亮度計（有403nm波長）。

 

1．2徑長1cm的吸收池。

 

2操作精確量取樣品1.0ml，用蒸餾水或0.15mol/L氯化鈉準確稀釋至1%蛋白質溶液，置吸收池中，在光路1cm，波長403nm處用分光亮度計測定。

 

人白蛋白殘留鋁離子會計師測定（鋁試劑法）1試劑1.1鹽酸（1∶9）10ml濃鹽酸加90ml蒸餾水。

 

1.20.2%鋁試劑溶液0.2g鋁試劑加100ml蒸餾水溶解。

 

1.310%醋酸銨溶液稱取10g醋酸銨（AR），加蒸餾水溶解并稀釋至100ml。

 

1.4準鋁溶液（10μg鋁/ml）精密稱取明礬[KAl（SO4）2·12H2O]（AR，無風化）0.3518g，加1.5mol/lHCl8ml，加蒸餾水到500ml，為40μg鋁/ml的標準濃溶液。

 

臨用時精確量取2.5ml標準鋁濃溶液于10ml容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，為10μg鋁/ml標準液。

 

1.54mol/LNaOH溶液稱取40gNaOH(A.R)，加蒸餾水溶解并稀釋至250ml。

 

1.60.5mol/LNaOH溶液取50ml4mol/LNaOH加蒸餾水至400ml。

 

1.70.1mol/LHCl溶液1ml濃HCl（A.R）加蒸餾水至120ml。

 

取溴麝香草酚藍0.1g,加0.05mol/LNaOH3.2ml,溶解，再加水衡稀釋至200m。

 

2操作2.1樣品精密量取1ml樣品于凱氏消化瓶內，加1ml濃H2SO4于電爐上消化。

 

從濃的白煙生成到白煙基本消除，再繼續消化15分鐘，稍冷，向消化瓶中另入適量H2O2，于電爐上繼續消化至無氣泡生成，消化液呈無色透明。

 

待冷后，用4mol/LNaOH中和消化液（10%白蛋白加5ml4mol/LNaOH）。

 

然后將消化液轉移至10ml容量瓶中，并用蒸餾水稀釋至刻度。

 

取2ml稀釋液于25ml帶塞比色管中（取2管）。

 

另取2ml稀釋液于50ml三角燒瓶中，向三解燒瓶中加2滴BTB指示劑，如變藍，用0.1mol/LHCl滴定至黃綠色；

 

如為黃色就用0.5mol/LNaOH滴定至黃綠色或淺藍色。

 

用此方法將2ml樣品或對照稀釋液的pH值調至5.5~8.5，按此量將比色管內的稀釋液pH值調至5.5~8.5。

 

加1mlHCl(1∶9)，加蒸餾水使其總體積不超過17ml，加0.2%鋁試劑1ml、10%醋酸銨溶液5ml，加蒸餾水至25ml。

 

加塞搖勻。

 

放置20分鐘后，用530nm波長測其吸收度（OD值）。

 

同時做空白對照，用1ml蒸餾水代替1ml樣品，其余操作同樣品。

 

2.2標準曲線精密量取標準鋁溶液（10μg鋁/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml帶塞比色管中，鋁含量分別為0、2、4、6、8、10μg，從加1mlHCl（1∶9）起同樣品管。

 

3計算3.1由標準曲線查出，或從標準計算出的直線回歸方程中求出對照管和樣品管的鋁含量（A）。

 

3.2根據中和用去的堿量計算出2ml樣品和對照稀釋液中含4mol/LNaOH的ml數。

 

3.3根據2ml對照稀釋液含的4mol/lNaOH量和含鋁量，計算出每ml4mol/lNaOH含鋁量。

 

3.4根據每ml4mol/lNaOH含鋁量和2ml樣品稀釋液中含4mol/lNaOH的ml數，計算出2ml樣品稀釋液中，中和用的4mol/lNaOH含鋁量（B）。

 

3.5計算樣品中含鋁量樣品中含鋁量（μg/g蛋白）=[（A－B）÷2×10]÷蛋白含量（g/ml）附注1．鋁試劑不僅能與某些金屬離子形成有色的絡合物，同時也會由于溶液中H 濃度的改變而產生顏色的變化。

 

因此測定時，要嚴格控制溶液的pH值在5.0左右，樣品和標準的pH值一致。

 

2．鋁試劑避光保存。

 

人白蛋白（或丙種球蛋白）純度測定（醋酸纖維素薄膜電泳法）1試劑1.1巴比妥緩沖液（Ph8.6）取巴比妥2.76g，巴比妥鈉15.45g，加蒸餾水溶解成1000ml。

 

1.20.5%氨基黑染色液取氨基黑10B0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及蒸餾水40ml的混合液中。

 

1.3漂洗液取乙醇45ml，冰醋酸5ml及蒸餾水50ml，混勻。

 

1.40.2mol/L氫氧化鈉取8g氫氧化鈉，加蒸餾水溶解成1000ml。

 

1.5透明液取冰醋酸25ml，加無水乙醇75ml，混勻。

 

2操作2.1電泳將膜條（2×8cm）粗糙面向下，浸入巴比妥緩沖液中，待完全浸透，取出用濾紙吸去多余的緩沖液，將膜條粗糙面向上，加于電泳支架上的濾紙橋上（或橋下），于膜上距負極端2cm處，直線狀滴加蛋白質含量約5%的樣品2～3μl，通電，電流控制在0.4~0.6mA/cm[總電流量=生產要膜的寬度（cm）×膜條數]，同時取新鮮人血清作對照，電泳時間以白蛋白與丙種球蛋白之間的電泳展開距離達3～4cm為宜。

 

2.2染色電泳完畢，將膜條取下浸于染色液中，2～3分鐘后，用漂洗液反復漂洗至底色完全脫凈。

 

2.3透明將漂凈并完全干后的膜條浸于透明液至全部浸透為止，取出平鋪于潔凈的玻璃板上，干后即成透明薄膜，可供掃描法測定樣品純度和作為標本長期保存用。

 

2.4純度測定2.4.1洗脫法：將漂洗凈的膜條用濾紙吸干，與正常人血清的電泳圖譜作對照，剪下白（或丙種球蛋白）帶A及其他雜蛋白質區帶B，分別浸于5ml0.2mol/L氫氧化鈉溶液中，振搖數次，至色澤完全浸出后，于620nm波長下測其OD值，以相同條件下，無蛋白質部分的膜條（其長度分別同A及B）作空白對照。

 

樣品中白蛋白（或丙種球蛋白）含量%=A的OD值－A空白的OD值/（A的OD值－A空白的OD值） （B的OD值－B空白的OD值）×100%2.4.2掃描法：將干燥的樣品醋酸纖維素薄膜電泳圖譜放入自動光密度掃描儀，通過反射（未透明薄膜）或透射（已透明薄膜）方式測定各蛋白質電泳區帶的OD值，根據儀器性能，可自動或手工方法計算出樣品白蛋白（或丙種球蛋白）的百分含量。

 

附注用掃描法測定白蛋白（或丙種球蛋白）純度時，可采用麗春紅染色法，其染色液及漂洗液配方如下：0.2%紅染色液：取麗春紅0.2g，磺基水楊酸3g及三氯醋酸3g，用蒸餾水溶解并稀釋至100ml。

 

漂洗液：取冰醋酸3ml，用蒸餾水稀釋至100ml。

 

殘留聚乙二醇（PEG）含量測定1試劑1.1PEG（MW4000或6000）。

 

1.20.5mol/L高氯酸（HClO4）溶液。

 

1.35�Cl2溶液。

 

1.40.1mol/L碘溶液。

 

2操作2.1取1ml樣品，在靈敏度允許的范圍內，先將樣品稀釋到蛋白質濃度≤1%，加入5.0ml0.5mol/L高氯酸溶液，15分鐘后，用4000r/min，離心10分鐘，取上清液（如蛋白濃度過高，上清混濁，則要過濾至清）。

 

2.2PEG測定于4ml上清液中加入1.0ml5�Cl2和0.5ml的0.1mol/L碘溶液，反應15分鐘后，進行比色。

 

記錄各樣品的A535值。

 

2.3標準曲線的繪制取≤1%蛋白質溶液，另入PEG合成10～80μg/ml溶液。

 

根據樣品的大致濃度，用去除蛋白質后溶液制劑作標準曲線。

 

2.4根據樣品讀數，從標準曲線上查出PEG含量。

 

3計算樣品中PCG濃度%（g/ml）=樣品稀釋倍數×查得標準曲線相應的PEG濃度附注1.整個比色過程應在試劑加入以后的15～45分鐘內完成，否則將要影響結果。

 

2.本方法的靈敏度隨被測定PEG的分子量的增加而提高。

 

人血白蛋白多聚體含量及人血丙種球蛋白中lgG各組份測定（高壓液相凝膠柱色譜法）1儀器1.1高壓液相泵1.2高壓液相色譜柱：TSKG3000SW(直徑7.5mm,長60cm)。

 

TSkGuardColumnSW（直徑7.5mm，長7.5cm）。

 

2試劑2.1貯存液A：0.5mol/LNaH2PO4,pH4.8稱39gNaH2PQ4·2H2O，用超純水溶解，并稀釋至500ml。

 

2.2貯存液B：0.5mol/LNa2HPO4稱179.1gNa2HPO4·12H2O，用超純水溶解，并稀釋至1000ml。

 

2.3工作液C：0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，Ph7.0（含1%異丙醇）準確量取200ml貯存液A、420ml貯存液B、914.5ml超純水、15.5ml異丙醇，混勻，用0.45μm水溶性膜過濾并超聲脫氣。

 

3樣品處理用生理鹽水將樣品稀釋至4mg/ml，然后用0.45μm水溶性膜過濾。

 

4操作用工作液C以0.6ml/分鐘流速平衡高壓液相系統至基線平穩。

 

取處理過的樣品25μl上柱，用工作液C以0.6ml/分鐘流速洗脫，同時在紫外檢測器280nm波長下記錄色譜圖及有關數據。

 

記錄數據的時間為60分鐘。

 

5計算5.1人血白蛋白多聚體含量計算用高壓液相系統的色譜工作站或積分儀對試驗結果進行數據處理，算出多聚體相對面積百分含量。

 

再根據轉化公式換算成相對重量百分含量。

 

轉化公式*X（%）=Y－1.6504/1.6359其中X為凱氏定氮結果，Y為高壓液相結果（如Y值小于1.6504，結果不用轉化成重量百分含量，但在試驗報告中需注明為相對面積百分含量）。

 

5.2人血丙種球蛋白中IgG各組份相對含量計算。

 

5.2.1IgG各組份峰的劃界。

 

圖譜中各峰的界限為兩峰間最低點到基線的垂直線。

 

5.2.2IgG各組份相對含量計算。

 

用高壓液相系統的色譜工作站或積分儀對試驗結果進行數據處理，算出各組份相對百分含量。

 

*應根據各單位使用的HPLC儀器及層析柱型號，經試驗后得出轉化公式。

 

人血白蛋白中辛酸鈉含量測定（氣相色譜法）1試劑1.1氯仿（A.R）1.2辛酸（CP）標準液用氯仿配成10mg/ml溶液。

 

1.3庚酸（CP）內示液用氯仿酸成10mg/ml溶液。

 

1.41.5mol/L高氯酸溶液2儀器2.1帶有積分儀及氫火焰檢測器的氣相色譜儀。

 

2.2色譜柱色譜柱為內徑3mm，長2m的玻璃柱，內裝涂有10%聚乙二醇（20M）固定液的ChromsorbVV擔體。

 

2.3儀器工作條件氣化室溫度230℃，柱溫190℃，載氣（純氮）流速40ml/分鐘；

 

樣品，標準液注入量為2μl。

 

2.4振蕩器3操作3.1標準曲線的繪制取1.2項的辛酸標準液各10、20、30、40及50μl，分別與30μl.3項的庚酸內標液和4ml的氯仿組成5個標準管，混合均勻后，在通風櫥中將氯仿揮發至干，然后定量加入0.1ml氯仿溶解殘渣，上機測定。

 

典型的色譜圖中內標庚酸的保留值為9分鐘左右，辛酸的保留值為13分鐘左右。

 

分別以自動積分儀顯示的各管樣品的辛酸和內標庚酸的峰面積之比，對各管中所含辛酸加入量進行回歸統計，也可得到回歸方程。

 

3.2樣品測定步驟取已知蛋白濃度樣品，用蒸餾水稀釋至5%蛋白濃度，然后準確取0.5ml，加入庚酸內標液30μl，1.5mol/L高氯酸0.2ml，在振蕩器上混合均勻，然后加入氯仿4ml，加蓋，用振蕩器劇烈混合1分鐘，2800r/min離心10分鐘。

 

用濾紙卷條小心吸去上層水，再用吸管小心吸出氯仿層，移入10ml管子中，在通風櫥中待氯仿揮發至干，精確加入0.1ml氯仿，溶解殘渣，上機測定。

 

4計算4.1根據樣品測定時所得的辛酸與內標庚酸的峰面積比代入已得回歸方程，即得辛酸絕對含量。

 

白蛋白中辛酸量（mmol/g蛋白）=測得辛酸絕對量（μg）/144.22×0.5×樣品蛋白濃度×100注：1.辛酸量（mmol）相等于辛酸鈉量（mmol）。

 

2.辛酸分子量為144.22。

 

F（ab）2含量測定1試劑1.1丙烯酰胺溶液取丙烯酰胺14g，雙丙烯酰胺0.367g，加蒸餾水至50ml。

 

1.2緩沖液Ph7.2，0.2mol/LPB-0.2%SDS：取NaH2PO4·2H2O17.8g,Na2HPQ4·12H2O103g,SDS4g，加蒸餾水至2000ml。

 

1.3樣品結合液取10%SDS4ml,0.2mol/LPB0.2ml，甘油10ml，加蒸餾水至20ml。

 

1.4電極緩沖液取上述1.2項緩沖液稀釋1倍。

 

1.5固定液取甲醇400ml，冰醋酸70ml，加蒸餾水至1000ml。

 

1.6染色液取考馬斯亮藍2.5g，溶于500ml甲醇中，加冰醋酸70ml，再加蒸餾水至1000ml。

 

1.7脫色液取冰醋酸70ml，甲醇50ml，加蒸餾水至1000ml。

 

1.8干燥液取甘油30ml，甲醇200ml，加蒸餾水至1000ml。

 

2操作2.1樣品處理取一定蛋白質濃度的樣品0.1ml，加樣品結合液0.1ml，100℃翥沸1～2分鐘，或37℃2小時，冷卻。

 

2.2凝膠板制備按下列比例制備所需量凝膠溶液∶0.2mol/LPB∶丙烯酰胺溶液∶水∶1.5%過硫酸銨=2∶1∶0.8∶0.25。

 

最后加1～2滴四甲基乙二胺（TEMED），混勻后立即將膠液加入電泳槽的玻璃板間，要避免產生氣泡。

 

2.3加樣于每一樣品孔內加入已經處理過的樣品25μg蛋白。

 

2.4電泳電泳條件為每個樣品孔的電流恒定為2～3mA。

 

當溴酚藍電泳至底部時停止電泳。

 

2.5固定將電泳后的膠板放入固定液中，過夜。

 

2.6染色及脫色于染色液中染色1～2小時，然后置脫色液中進行脫色，直至底色成為無色為止。

 

2.7干燥保存用適宜方法干燥。

 

3結果計算將干燥前或后的膠板用掃描儀于575nm或520nm處對每一樣品進行掃描，得出（或計算出）樣品中F（ab）2的百分含量。

 

莢膜多糖抗原分子大小測定（瓊聚糖4B柱層析法）1試劑1.1瓊聚糖4B凝膠。

 

1.20.2mol/L氯化鈉溶液，pH7.0洗脫液。

 

1.3藍色葡聚糖2000（2～4mg）加維生素B12（0.2mg），加蒸餾水1ml溶解。

 

2儀器2.1層析柱（1.5～1.6×100cm）。

 

2.2206nm波長紫外監測儀。

 

2.3部分收集器及試管。

 

2.4凝膠和洗脫液儲瓶，適宜的控制裝置和記錄器。

 

3操作3.1瓊聚糖4B凝膠的漂洗取瓊聚糖4B凝膠約300ml，加0.2mol/L氯化鈉溶液500ml，充分攪拌，靜置1～2小時，傾去上層液體和懸浮于其中的細小顆粒，重復上述操作數次后至上層液體無細小顆粒，置真空罐內，抽去凝膠中的空氣。

 

3.2裝柱將洗好的瓊聚糖4B凝膠慢慢注入柱中，避免夾雜氣泡，裝至約90cm，調整流速為10～12ml/小時，流洗2天。

 

3.3標定空流體積（Vo）及柱床總體積（Vi）取藍色葡聚糖及維生素B12溶液1ml，加于已平衡的柱上，以0.2mol/L氯化鈉溶液流洗，用部分收集器收集各組分，流速為10～12ml/小時，每管2～4ml，同時于206nm波長下自動監測，記錄流洗液圖譜。

 

第一峰為藍色葡聚糖峰，計算由加樣起至第一峰峰頂的流洗液體積，即為Vo。

 

第二峰為維生素B12峰，計算由加樣起至第二峰峰頂的流洗液體積，即為Vi。

 

3.4多糖抗原Kd值的測定3.4.1取約1ml樣品（含多糖抗原3～5mg，凍干樣品可用1.2項溶液溶解）。

 

加于已標定的瓊聚糖4B膠柱上，用0.2mol/L氯化鈉溶液流洗，流洗液用量為柱床總體積的1.5倍，每管收集2～4ml，同時于206nm波長下自動監測，記錄流洗液圖譜，由加樣起至多糖峰峰頂流洗體積為Ve，計算分配系數（Kd）。

 

Kd=Ve―Vo/Vi―Vo3.4.2Kd≤0.5多糖抗原回收率的計算用求積儀分別計算Kd值0.5以前組分峰的面積除以所有組分峰的面積，即得Kd≤0.5多糖抗原回收率。

 

Kd≤0.5多糖回收率（%）=Kd0.5以前組分峰的面積/所有組分峰的總面積×100注意：過柱操作在10～20℃下進行。

 

O－乙酰基含量測定1試劑1.12mol/L鹽酸羥胺，冷處保存。

 

1.23.5mol/L氫氧化鈉。

 

1.34mol/L鹽酸濃鹽酸（比重1.18）1份，加2份蒸餾水稀釋。

 

1.40.37mol/L三氯化鐵（FeCl3·6H2O），溶解于0.1mol/L鹽酸內。

 

1.50.001mol/L醋酸鈉（pH4.5）。

 

1.62.5mmol/L的氯化乙酰膽堿液精確稱取已干燥至恒重的氯化乙酰膽堿22.7mg，用0.001mol/L醋酸鈉液（pH4.5）溶解，移入50ml容量瓶中，用0.001mol/L醋酸鈉液稀釋至刻度。

 

2操作2.1樣品精確量取樣品1ml（含O-乙酰基0.5～2.5μmol）置于試管中，加2ml新鮮配制的堿性羥胺液（等體積的2mol/L鹽酸羥胺與3.5mol/L氫氫化鈉混合，3小時內可用），搖勻，于室溫放置4分鐘，加1ml4mol/L鹽酸，使pH為1.2±0.2，搖勻，加1ml0.37mol/L三氯化鐵，搖勻，于540nm比色，同時作一樣品空白，取樣品1ml于試管中，先加1ml4mol/L鹽酸，后加2ml堿性羥胺（即加酸與加堿性羥胺的次序顛倒），加三氯化鐵等操作同上。

 

2.2標準曲線精確量取氯化乙酰膽堿（或溴化乙酰膽堿）標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置于試管中，加蒸餾水補至1ml，其余操作同樣品，同時作標準空白，即作與上相同的系列標準管，只是加酸與加堿性羥胺的次序顛倒，其他操作均同。

 

3計算標準管比色讀數分別減去各自空白比色讀數，然后畫出標準曲線。

 

樣品比色讀數減去其空白讀數，再從標準曲線查出品相當標準液之ml數A。

 

樣品O-乙酰基含量（mmol/L）=A×2.5附注也可采用WHO規程法，但應相應提高樣品用量。

 

磷含量測定1試劑1.1高氯酸。

 

1.2濃硫酸。

 

1.330%過氧化氫。

 

1.40.04mol/L鉬酸銨取鉬酸銨5g，加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.5還原劑稱取亞硫酸氫鈉6g，亞硫酸鈉1.2g，1-氨基-2-茶酚磺酸0.1g，加蒸餾水溶解成50ml，置棕色瓶中保存，一周內可用。

 

1.6磷標準液精確稱取已干燥至恒重的磷酸二氫鉀439.3mg，加蒸餾水溶解，移入100ml容量瓶中，稀釋至刻度，為貯備液（1mg磷/ml）。

 

精確量取貯備液2ml，于100ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，為磷標準液（20μg/ml）。

 

2操作2.1樣品A群腦膜炎球菌多糖菌苗成品測磷至少取三支安瓿溶解后混合使用。

 

精確量取一定體積樣品（含磷4～20μg）于刻度試管中，加4滴濃硫酸（約0.08ml），加熱至炭化，再加2滴高氯酸（約0.06ml），消化至無色澄清，必要時可加1～2滴30%過氧化氫，但最后必須將過氧化氫除盡。

 

消化后稍置片刻，趁熱另2ml蒸餾水（如冷卻后加水，需再加熱），加0.4ml0.04mol/L鉬酸銨，混勻，加0.2ml還原劑，混勻，另蒸餾水至6ml，15～20分鐘后，于820nm波長比色。

 

2.2標準曲線精確量取磷標準液（20μg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置于刻度試管中，補加蒸餾水至1ml，其余操作同樣品，可得一標準曲線。

 

3計算從標準曲線查出樣品相當標準液之ml數A。

 

樣品磷含量（μg/ml）=A×20/樣品ml數核酸含量測定取含A群腦膜炎多糖抗原5±1mg/ml溶液，采用紫外分光法于260nm波長測定OD值，按E1m=200計算核酸含量。

 

核糖含量測定1試劑1.10.31mol/L三氯醋酸稱取三氯醋酸5g，加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.20.61mol/L三氯醋酸稱取三氯醋酸10g，加蒸餾水溶解成100ml。

 

1.30.019mol/L三氯化鐵-鹽酸溶液稱取三氯化鐵（FeCl3·6H2O）0.5g，加濃鹽酸溶解成500ml，可長期使用。

 

1.41%二羥基甲苯（苔黑酚）稱取二羥基甲苯1g，溶于0.019mol/L三氯化鐵-鹽酸溶液中，臨用新配。

 

1.5標準核糖溶液精密稱取D核糖20mg，溶于0.31mol/L三氯醋酸，準確稀釋至100ml為200μg/ml核糖標準貯備液。

 

精密吸取貯備液2.5ml于25ml容量瓶中，用0.31mol/L三氯醋酸稀釋至刻度，即為標準核糖溶液（20μg/ml）。

 

2操作精密量取轉移因子待檢品1ml于試管中，另0.61mol/L三氯醋酸1ml，置沸水浴水解15分鐘，再吸取水解液0.4ml，加0.31ml/L三氯醋酸1.6ml,及1%二羥基甲苯2ml,混勻,再置沸水浴中加熱30分鐘,冷卻至室溫,在650nm波長測定OD值,同時準確吸取核糖標準液1ml,加0.31mol/L三氯醋酸1ml,混勻,其余操作同樣品,并做空白對照。

 

3計算樣品OD值核糖含量(μg/ml)=─────×20×5標準OD值

 

引用：http://big5.wiki8.com/shengwuzhipinhuaxueguidingguicheng_115754/