【醫學百科●總RNA提取】
本帖最後由 楊籍富 於 2013-1-9 07:22 編輯 <br /><br /><P align=center><STRONG><FONT size=5>【<FONT color=red>醫學百科●總RNA提取</FONT>】</FONT></STRONG></P><P><STRONG></STRONG> </P>
<P><STRONG>拼音</STRONG></P>
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<P><STRONG>zǒngRNAtíqǔTrizolReagent<BR><BR>處理法</STRONG></P>
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<P><STRONG>原理分離純凈、完整的RNA分子對于分子克隆的實驗是很重要的，而且是進行基因表達分析的基礎。</STRONG></P>
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<P><STRONG>在總RNA中，75-85%為rRNA（主要是28S-26S/23S和18S/16SrRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等組成。</STRONG></P>
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<P><STRONG>為了獲得高質量的RNA，必須要控制RNA酶的活性，也就是要避免RNA酶的污染。</STRONG></P>
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<P><STRONG>RNA酶很穩定，而且反應不需要輔助因子，因而在RNA的制備過程中只要存在少量的RNA酶就會導致實驗的失敗。</STRONG></P>
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<P><STRONG>為避免RNA酶的污染，實驗中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需要特別處理。</STRONG></P>
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<P><STRONG>RNA酶的抑制劑主要有異硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯（DEPC，使用濃度為0.05%-0.1%）、釩氧核糖核苷復合物（10mmol/L）、蛋白質抑制劑RNasin。</STRONG></P>
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<P><STRONG>實驗中采用DEPC對所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等進行處理。</STRONG></P>
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<P><STRONG>儀器與試劑儀器燒杯（1000，500，100，50mL若干）；</STRONG></P>
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<P><STRONG>量筒（1000，500，250，50，20mL若干）；</STRONG></P>
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<P><STRONG>玻璃棒、藥勺、試劑瓶、三角瓶、吸頭（1000，200，20微升）、吸頭盒、離心管（1.5mL，0.2mL）、冷凍高速離心機、紫外分光光度計等。</STRONG></P>
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<P><STRONG>試劑滅菌的DEPC水、氯仿：異戊醇（24：1）、異丙醇、75%乙醇、TrizolReagent、</STRONG></P>
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<P><STRONG>實驗步驟準備工作：用DEPC（1ml/L）水溶液處理槍頭、離心管等24hr，然后高溫滅菌2次，每次20min；</STRONG></P>
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<P><STRONG>研缽、剪刀等其他用具在180℃下烘3hr。</STRONG></P>
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<P><STRONG>1、組織勻漿，在液氮中將組織研碎后，加入500μlTrizol后再充分研磨，用槍頭將粉末轉移到離心管中，加入500μlTrizol后用注射器抽打均勻，室溫下放置5min；</STRONG></P>
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<P><STRONG>2、加200μl氯仿，劇烈振蕩15sec，顛倒幾次，室溫下放置15min；</STRONG></P>
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<P><STRONG>3、4℃下12,000rpm離心15min；</STRONG></P>
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<P><STRONG>4、轉移上清液至一新的離心管（DEPC處理）中，加500μl異丙醇，振蕩混勻，室溫下放置5～10min；</STRONG></P>
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<P><STRONG>5、4℃下12,000rpm離心8min；</STRONG></P>
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<P><STRONG>6、棄上清液，加1ml75%乙醇，漩渦混勻（或加無水乙醇以加快揮發）；</STRONG></P>
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<P><STRONG>7、4℃下7,500rpm離心5min；</STRONG></P>
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<P><STRONG>8、棄乙醇，空氣風干3～5min，用DEPC處理過的水（先在55～60℃水浴10～15min）溶解,根據沉淀的量，一般加入30～50μl；</STRONG></P>
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<P><STRONG>9、RNA質量的檢測，取1μlRNA樣品稀釋100倍后測定RNA濃度及OD260/280；</STRONG></P>
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<P><STRONG>10、RNA保存于-80℃冰箱。</STRONG></P>
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<P><STRONG>引用：<A href="http://big5.wiki8.com/zongRNAtiqu_48489/" target=_blank>http://big5.wiki8.com/zongRNAtiqu_48489/</A></STRONG></P>
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